Stencil micropatterning van menselijke pluripotente stamcellen voor Probing ruimtelijke organisatie van Differentiatie Fates
Summary
Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) hebben de intrinsieke vermogen om onderscheid te maken en zichzelf organiseren in verschillende weefsel patronen; hoewel dit vereist de presentatie van ruimtelijke milieu-hellingen. Wij presenteren stencil micropatterning als een eenvoudige en robuuste methode om biochemische en mechanische gradiënten genereren voor het besturen van HPSC differentiatie patronen.
Abstract
Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into all three germ layers. This makes them an attractive cell source for regenerative medicine and experimental modeling of normal and diseased organogenesis. However, the differentiation of hPSCs in vitro is heterogeneous and spatially disordered. Cell micropatterning technologies potentially offer the means to spatially control stem cell microenvironments and organize the resultant differentiation fates. Micropatterning hPSCs needs to take into account the stringent requirements for hPSC survival and maintenance. Here, we describe stencil micropatterning as a method that is highly compatible with hPSCs. hPSC micropatterns are specified by the geometries of the cell stencil through-holes, which physically confine the locations where hPSCs can access and attach to the underlying extracellular matrix-coated substrate. Due to this mode of operation, there is greater flexibility to use substrates that can adequately support hPSCs as compared to other cell micropatterning methods. We also highlight critical steps for the successful generation of hPSC micropatterns. As an example, we demonstrate that stencil micropatterning of hPSCs can be used to modulate spatial polarization of cell-cell and cell-matrix adhesions, which in turn determines mesoendoderm differentiation patterns. This simple and robust method to micropattern hPSCs widens the prospects of establishing experimental models to investigate tissue organization and patterning during early embryonic development.
Introduction
Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs), waaronder embryonale stamcellen (hESCs) en geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs), wordt gebruik moeten regeneratieve geneeskunde en experimentele modellering van normale en zieke organogenese vanwege hun differentiatie potentieel in cellijnen van drie kiem lagen 1,2. De differentiatie lot van hPSCs zijn zeer gevoelig voor lokale omgevingsfactoren die autocriene of paracriene signalen 1 en mechanotransductie processen gemedieerd door fysische signalen 3-5 kunnen moduleren. Micropatterning cel omvat een reeks technieken die zijn ontwikkeld om ruimtelijk organiseren van de geometrie en de locatie van een celpopulatie als een middel om de lokale cellulaire micro-omgeving regelen, zoals cel-cel interacties 6 en cel-matrix interacties 3. In de context van hPSCs is cel micropatterning toegepast om belangrijke inzichten in hoe niche-afhankelijk krijgenent autocriene signalering moduleert hESC pluripotentie-differentiatie beslissingen 7 en organisatie in de vroege embryonale differentiatie patronen 6. 2D en 3D micropatterned hPSCs zijn gebruikt om de kolonie grootte van multicellulaire patronen, waardoor differentiatie factoren van invloed zijn op de drie kiemlagen 8,9 beheersen. We hebben multicellulaire HPSC micropatterns toegepast om de mate van cel-cel en cel-matrix interacties te moduleren bij een HPSC kolonie sonderen hoe integrine-E-cadherine overspraak tot lot van de cel heterogeniteit 10 kunnen geven. De demonstratie van de bovenstaande rapporten opent nieuwe wegen naar de toepassing van meercellige micropatterns van hPSCs als experimentele modellen voor geneesmiddeltoxiciteit screenen op ontwikkelingsziekten 11, om het effect van groeifactoren en hormonen studie tijdens weefsel of orgaan ontwikkeling en de vorming van ontrafelen weefsel patronen.
Een groot aantal cel micropatterning technieken ontwikkeld zoals beoordeeld door Falconnet et. al. 12, maar slechts een handvol, zoals micro-contact afdrukken 7,8,13, microwell cultuur 14,15, photopatterning 6 en microstencils 16 zijn met succes geïmplementeerd hPSCs. De uitdaging met micropatterning hPSCs ligt in hun kwetsbaarheid en een strenge eis van specifieke extracellulaire matrix (ECM) en de groeiomstandigheden voor celhechting en overleving. 2D HPSC patronen, micro-contactdruk is een van de meest gebruikte methoden voor HPSC micropatterns met weefselkweek en glassubstraten 13 genereren. De werkwijze kan worden gebruikt om gemeenschappelijke patroon ECM gebruikt HPSC cultuur, zoals laminine en basaalmembraan matrices, zoals Matrigel. Het vereist echter typisch een tweestaps bekledingswerkwijze geholpen door Poly-D-Lysine en specifieke behoeften inerte atmosfeer en vochtigheidsgraad stabiele ECM micropatterns maken hPSCs te bevestigen op 6,13. De belangrijkste overweging van elk micropatterning methode is de vraag of de modificatie van het oppervlak regime HPSC-lijm ECM patronen op de gewenste geometrische resolutie kan genereren, terwijl het minimaliseren aspecifieke celhechting naar de omliggende gebieden.
Hier melden wij het gebruik van stencil micropatterning een eenvoudige methode om HPSC micropatterns genereren zonder andere oppervlaktemodificatie stappen voor de generatie van lijm patronen voor ECM hPSCs te bevestigen op. De cel stencil bestaat uit een dun membraan, bijvoorbeeld polydimethylsiloxaan (PDMS) plaat, met micron op maat doorlopende gaten verzegeld op een celcultuur substraat fysiek ECM coatings en vervolgens uitgezaaid hPSCs bevatten millimeter. Stencilsets patroonvorming werkt door het fysiek beperken van de locatie waar HPSC direct naar onderliggende ECM beklede substraat toegang en voeg deze methode is geschikt voor diverse substraten die HPSC culturen kunnen ondersteunen. De enige requirement is dat de keuze van sjabloon materiaal een omkeerbare afdichting met het substraat kan vormen. Deze substraten omvatten gebruikelijke weefselkweek polystyreen (TCPS) 17, ligand geconjugeerd substraten 18, alsook elastomere substraten met instelbare stijfheid (bijv., PDMS) 19. Deze methode maakt het ook mogelijk coating van verschillende ECM, zoals vitronectine (of VTN eiwit), laminine en basaal membraan matrices (bijv Matrigel en Geltrax) te zorgen voor een goede hechting en differentiatie van hPSCs. Daarom kunnen we doorzenden geoptimaliseerde ECM-substraat configuraties voor een specifiek HPSC lijn stencil micropatterning optimale cel-matrix hechting, overleving en differentiatie. Onlangs heeft een soortgelijke werkwijze ook gerapporteerd hepatische differentiatie micropatterning hESCs behulp poly (methylmethacrylaat) (PMMA) micro-arrays stencil 16 sturen.
Cell stencils kunnen worden vervaardigd van verschillende materialen, waaronder ontmoetteals 20,21, poly (p-xylyleen) polymeren 22,23, 16 en PMMA meest, PDMS 24-28. Silicium en poly (p-xylyleen) polymeren mallen vereisen directe etsen van de doorgaande gaten met 20-23 gespecialiseerde apparatuur, die de toegankelijkheid beperkt tot biologische gebruikers. PDMS mallen kunnen worden vervaardigd door verschillende methoden, afhankelijk van de functie vereiste grootte, die typisch varieert van 3 urn tot 2000 urn 11,26-29. Als kleine functies gewenst zijn, kan dunne sjabloneren platen worden geproduceerd door persvormen PDMS pre-polymeer op een microfabricated silicium template met reliëfs van de micropatterns 28. Voor elementen> 1000 urn, een CO 2 lasersnijmachine biedt een eenvoudige en goedkope manier om de patronen op een vooraf gegoten PDMS plaat tijdens fabricage stencil direct gesneden. De recycleerbaarheid van PDMS sjablonen maakt ze rendabel een reeks experimenten met voldoende consistentie voeren.
<p class = "jove_content"> Hier presenteren we de gedetailleerde methodologie voor de fabricage van een PDMS stencil met 1000 urn kenmerken door lasersnijden en het genereren van hESC micropatterns. Deze hESC micropatterns werden gebruikt voor het moduleren van de omvang van integrine en E-cadherine gemedieerde verklevingen in een hechte hESC kolonie om zo te onderzoeken hoe ruimtelijke polarisatie van celadhesie resulteerde in cel lot heterogeniteit 10.Protocol
Representative Results
Discussion
Fabricage van micropatterning stencils
Stencil micropatterning biedt een ideale methode om HPSC micropatterns te genereren voor het onderzoeken van niche-gemedieerde differentiatie patronen. Het belangrijkste voordeel van stencil patronen micropatterning boven andere technieken, zoals microcontactprinten en photopatterning, is dat het niet oppervlaktemodificatie vereist en kan worden uitgevoerd op conventionele TCPS substraten. Daarom kan geoptimaliseerd kweekmedium…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door NUS Start subsidie (R-397-000-192-133) en ETPL Gap Fund (R-397-000-198-592). GS is een NUS Research geleerde. Auteurs willen bedanken Dr. Jiangwa Xing voor haar technische ondersteuning op de mobiele micropatterning.
Materials
| 2 mm thick PDMS sheet | Specialty Silicone Products Inc., USA | SSPM823-.005 | Used to form reservoir for stencil |
| 120-150 μm thick PDMS sheet | Specialty Silicone Products Inc., USA | SSPM823-.040 | Used to form stencil |
| 60 mm petri dish | Nunc Nunclon Delta | 150326 | Substrate for micropatterning |
| Accutase | Accutase, Merck Millipore, Singapore | SCR005 | Enzyme to break H9 Cells into single cells |
| Activin | R&D Systems, Singapore | 338-AC-010 | Growth factor for H9 differentiation |
| BMP4 | R&D Systems, Singapore | 338-BP-010 | Growth factor for H9 differentiation |
| Plasma system | Femto Science, Korea | CUTE-MP | For plasma oxidation of stencil |
| Dispase | StemCell™ Technologies, Singapore | 7923 | Enzyme used to weaken the cell-ECM adhesion during passaging |
| DMEM/F12 | GIBCO, USA | 11330032 | Basal medium for H9 cells |
| FGF2 | R&D Systems, Singapore | 233–FB–025 | Growth factor for H9 differentiation |
| H9 Cell line | WiCell Research Institute, Inc., USA | WA09 | Human embryonic stem cells |
| hESC-qualified basement membrane matrix | Matrigel, BD Biosciences, Singapore | 354277 | Extra-cellular matrix coating to support growth of H9 cells |
| Inverted microscope | Leica Microsystems, Singapore | DMi1 | For capturing bright-field images |
| Laser cutter | Epilog Helix 24 Laser System | Used to generate through holes in PDMS sheet | |
| mTeSR™1 medium | StemCell™ Technologies, Singapore | 5850 | Maintainence medium for H9 cells |
| PDMS | SYLGARD® 184, Dow Corning Co., USA | 3097358-1004 | Used for sticking the PDMS stencil and reservior |
| ROCKi Y27632 | Calbiochem, Merck Millipore, Singapore | 688000 | Maintains H9 cells as single cells |
| STEMdiff™ APEL™ medium | StemCell™ Technologies, Singapore | 5210 | Differentiation medium for H9 cells |
| Polyethylene terephthalate film | SureMark Singapore | SQ-6633 | Used to form stencil |
| Cell culture compatible non-ionic surfactant | Pluronic acid F-127, Sigma, Singapore | P2443 | Passivating reagent to repel cell adhesion in non-micropatterned substrates |
Riferimenti
- Graf, T., Stadtfeld, M. Heterogeneity of embryonic and adult stem cells. Cell Stem Cell. 3 (5), 480-483 (2008).
- Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (9), 725-729 (2008).
- Guilak, F., Cohen, D. M., Estes, B. T., Gimble, J. M., Liedtke, W., Chen, C. S. Control of stem cell fate by physical interactions with the extracellular matrix. Cell Stem Cell. 5 (1), 17-26 (2009).
- Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nat Mater. 13 (6), 558-569 (2014).
- Joddar, B., Ito, Y. Artificial niche substrates for embryonic and induced pluripotent stem cell cultures. J Biotechnol. 168 (2), 218-228 (2013).
- Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nat Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
- Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. EMBO J. 26 (22), 4744-4755 (2007).
- Lee, L. H., Peerani, R., Ungrin, M., Joshi, C., Kumacheva, E., Zandstra, P. Micropatterning of human embryonic stem cells dissects the mesoderm and endoderm lineages. Stem Cell Res. 2 (2), 155-162 (2009).
- Hwang, Y. S., Chung, B. G., Ortmann, D., Hattori, N., Moeller, H. C., Khademhosseini, A. Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of WNT5a and WNT11. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (40), 16978-16983 (2009).
- Toh, Y. C., Xing, J., Yu, H. Modulation of integrin and E-cadherin-mediated adhesions to spatially control heterogeneity in human pluripotent stem cell differentiation. Biomaterials. 50, 87-97 (2015).
- Xing, J., Toh, Y. C., Xu, S., Yu, H. A method for human teratogen detection by geometrically confined cell differentiation and migration. Sci Rep. 5, 10038 (2015).
- Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Khademhosseini, A., et al. Co-culture of human embryonic stem cells with murine embryonic fibroblasts on microwell-patterned substrates. Biomaterials. 27 (36), 5968-5977 (2006).
- Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. 3-D microwell culture of human embryonic stem cells. Biomaterials. 27 (36), 6032-6042 (2006).
- Yao, R., et al. Hepatic differentiation of human embryonic stem cells as microscaled multilayered colonies leading to enhanced homogeneity and maturation. Small. 10 (21), 4311-4323 (2014).
- Mei, Y., et al. Combinatorial development of biomaterials for clonal growth of human pluripotent stem cells. Nat Mater. 9 (9), 768-778 (2010).
- Melkoumian, Z., et al. Synthetic peptide-acrylate surfaces for long-term self-renewal and cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 28 (6), 606-610 (2010).
- Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur Cell Mater. 18, 1-13 (2009).
- Carter, S. B. Haptotactic islands: a method of confining single cells to study individual cell reactions and clone formation. Exp Cell Res. 48 (1), 189-193 (1967).
- Jimbo, Y., Robinson, H. P., Kawana, A. Simultaneous measurement of intracellular calcium and electrical activity from patterned neural networks in culture. IEEE Trans Biomed Eng. 40 (8), 804-810 (1993).
- Wright, D., et al. Reusable, reversibly sealable parylene membranes for cell and protein patterning. J Biomed Mater Res. A. 85 (2), 530-538 (2008).
- Jinno, S., et al. Microfabricated multilayer parylene-C stencils for the generation of patterned dynamic co-cultures. J Biomed Mater Res A. 86 (1), 278-288 (2008).
- Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. M. Using elastomeric membranes as dry resists and for dry lift-off. Langmuir. 15 (8), 2973-2984 (1999).
- Folch, A., Jo, B. H., Hurtado, O., Beebe, D. J., Toner, M. Microfabricated elastomeric stencils for micropatterning cell cultures. J Biomed Mater Res. 52 (2), 346-353 (2000).
- Park, J., et al. Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation. Lab Chip. 7 (8), 1018-1028 (2007).
- Choi, J. H., Lee, H., Jin, H. K., Bae, J. S., Kim, G. M. Micropatterning of neural stem cells and Purkinje neurons using a polydimethylsiloxane (PDMS) stencil. Lab Chip. 12 (23), 5045-5050 (2012).
- Li, W., et al. NeuroArray: a universal interface for patterning and interrogating neural circuitry with single cell resolution. Sci Rep. 4, 4784 (2014).
- Guvanasen, G. S., Mancini, M. L., Calhoun, W. A., Rajaraman, S., DeWeerth, S. P. Polydimethylsiloxane Microstencils Molded on 3-D-Printed Templates. J Microelectromech S. 23 (5), 1045-1053 (2014).
- Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve. PLoS One. 7 (12), 51499 (2012).
- Chowdhury, F., et al. Material properties of the cell dictate stress-induced spreading and differentiation in embryonic stem cells. Nat Mater. 9 (1), 82-88 (2010).
- Gjorevski, N., Boghaert, E., Nelson, C. M. Regulation of Epithelial-Mesenchymal Transition by Transmission of Mechanical Stress through Epithelial Tissues. Cancer Microenviron. 5 (1), 29-38 (2012).
- Thery, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. J Cell Sci. 123, 4201-4213 (2010).
- Eroshenko, N., Ramachandran, R., Yadavalli, V. K., Rao, R. R. Effect of substrate stiffness on early human embryonic stem cell differentiation. J Biol Eng. 7 (1), 7 (2013).
