احتشاء عضلة القلب في الفئران حديثي الولادة، نموذج للتجديد القلب
Summary
This protocol describes a highly reproducible model of cardiac regeneration by surgical induction of myocardial infarction in the left ventricle of postnatal day 1 mice. The method involves induction of hypothermic anesthesia and ligation of the left anterior descending coronary artery.
Abstract
وقد استخدم احتشاء عضلة القلب الناجم عن ربط الشريان التاجي في العديد من النماذج الحيوانية كأداة لدراسة آليات إصلاح القلب وتجديد، وتحديد أهداف جديدة للعلاجات. على مدى عقود، وجدت نماذج من تجديد القلب الكامل في البرمائيات والأسماك، ولكن كان نظيره الثدييات غير متوفر. وقد أدى هذا الاكتشاف الأخير من نافذة ما بعد الولادة خلالها الفئران تمتلك قدرات التجدد لإنشاء نموذج الثدييات تجديد القلب. ويرد نموذج الجراحي لاعادة التجديد القلبي الثدييات في الماوس حديثي الولادة في هذه الوثيقة. لفترة وجيزة، يتم تخدير بعد الولادة اليوم 1 (P1) الفئران عن طريق الأيزوفلورين وضعها على وسادة الجليد للحث على انخفاض حرارة الجسم. بعد فتح الصدر، وتصور الأمامي الأيسر الشريان التاجي النازل (LAD)، يتم وضع خياطة حول الفتى لإلحاق نقص تروية عضلة القلب في البطين الأيسر. العملية الجراحية يستغرق 10-15 دقيقة. تصور الشريان التاجي هوحاسمة لوضع دقيق خياطة والتكاثر. وأكد احتشاء عضلة القلب وضعف القلب عن طريق ثلاثي فينيل-نتروبلو كلوريد (TTC) تلطيخ وتخطيط صدى القلب، على التوالي. يتم التحقق من تجديد كامل 21 يوما احتشاء عضلة القلب آخر من الأنسجة. هذا البروتوكول يمكن استخدامها لكأداة لتوضيح آليات تجديد القلب الثدييات بعد احتشاء عضلة القلب.
Introduction
احتشاء عضلة القلب (MI) هو السبب الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم، ويبقى مسؤولا عن حوالي ثلث حالات قصور القلب 1. في حين قدوم تدخل عن طريق الجلد والتحسين المستمر لاستخدام thrombolytics زاد ضخه التالية MI، الموت cardiomyocyte وفقدان عضلة القلب مقلص ذلك يحدث. تبقى هناك أيضا أعداد كبيرة من المرضى "لا خيار" الذين ليسوا مرشحين لأو لا نرى فائدة من هذه التدخلات. يستمر هؤلاء المرضى لتجربة نقص التروية تعطيل يؤدي إلى ندبة تشكيل وضار إعادة البطين كآلية للشفاء احتشاء. هذه العملية يؤدي في نهاية المطاف إلى فشل القلب، والتي لا يزال سوء التشخيص على الرغم من إدارة الدوائية المثلى مع الإنزيم (ACE) مثبطات المحول للأنجيوتنسين وحاصرات بيتا. وللأسف، فإن معدل وفيات سنة واحدة للمرضى الذين يعانون من ضعف شديد في وظائف البطين الأيسر لا يزال كمايصل الى 26٪ 2. زرع القلب هو خيار العلاج النهائي للمرضى المصابين بقصور في القلب. ومع ذلك، فإن تجمع المانحين محدود لزرع القلب لا يجعل هذا خيارا قابلا للتطبيق بالنسبة لمعظم المرضى. وهكذا، فإن اكتشاف العوامل العلاجية رواية لاستعادة عضلة القلب التالفة لا يزال بالغ الأهمية في حل مشكلة مرض القلب. وبالتالي هناك حاجة النماذج الحيوانية موثوقة للإصابة القلب باعتباره عنصرا حاسما في هذه العملية.
قد أملى العقيدة التقليدية التي العضلية الكبار هي مرحلة ما بعد الإنقسامية، لا شفاء خلايا متمايزة، قادرة على تقسيم أو إلغاء التمييز لاستبدال عضلة القلب التالفة 3. على هذا النحو، يمكن أن الكبار قلب الثدييات أبدا على التعافي تماما من الاصابة، وسيتم استبدال العضلية فقدت مع النسيج الليفي. وهكذا، ركزت الأبحاث في المقام الأول على العوامل العلاجية للحد من التوسع احتشاء وتقليل تشكيل ندبة. لكن في الآونة الأخيرة، حدث تحول جذريفي التفكير المحيطة شفاء القلب والعديد من الجهود البحثية تم توجيهها إلى التركيز على إمكانية تجديد القلب 4.
حتى وقت قريب، كان مقتصرا في الجسم الحي دراسة تجديد القلب إلى نماذج غير الفقارية، مثل تلك الموجودة في البرمائيات والأسماك مكتملة العظام urodele 5-7. ومع ذلك، فقد أدى اكتشاف القدرة على تجديد القلب في الماوس حديثي الولادة في تطوير نموذجين الجراحي لاعادة التجديد القلبي الثدييات: استئصال انسداد الشريان التاجي مهيمنة والقلب للحث على احتشاء عضلة القلب 8،9. في عام 2011، تم استخدام الماوس نموذج تقاطع رئيسية لإثبات أن تجديد القلب الكامل هو ممكن في يوم ما بعد الولادة 1 (P1). ومع ذلك، تنخفض هذه القدرة بسرعة بعد فترة ما بعد الولادة الأولى. قلب الثدييات يفقد قدرته على التجدد بعد الولادة في P7 كأرقام خلية سلفية انخفاض فترة وجيزة، والعضلية تصبح binucleated، وتفقدالكفاءة التكاثري، ووبشكل دائم الخروج من 10،11 دورة الخلية. فهم الاختلافات الجوهرية بين حديثي الولادة والقلب الثدييات الكبار قد تؤدي إلى رؤى جديدة في تجديد القلب.
في حين استئصال مهيمنة يقدم في الواقع نظرة ثاقبة إعادة نمو الأنسجة مقلص، نموذج لا محاكاة إصابة القلب الإنسان نموذجية، وبالتالي لا تصلح كذلك لتطوير علاجات. نموذج انسداد الشريان التاجي، ومع ذلك، يحاكي بشكل مباشر الجوانب الفسيولوجية المرضية من MI علم الأمراض، وبالتالي قد توفر معلومات أكثر فائدة في الآليات التي يمكن أن تنطبق على التقدم العلاجي للاستخدام البشري.
وقد استخدم ربط الشريان التاجي الجراحية كأسلوب التجريبية مفيدة في العديد من النماذج الحيوانية 12-14. في الشريان التاجي نموذج ربط الكبار، يتم تخدير الحيوانات ومدخل أنبوب للسماح فتح تجويف الصدر مع الحفاظ على respiratiعلى. لا يزال القلب ينبض بانتظام، والسماح التصور من الأوعية الدموية التاجية، والسماح للدقيق وضع خياطة. وعلاوة على ذلك، لا يزال قلب وردي مع استمرار التروية، وبعد ربط يظهر عضلة القلب الإقفاري شاحب، مشيرا إلى نجاح عملية ربط الشريان التاجي. بروتوكول صفها للفئران حديثي الولادة، ومع ذلك، هو أقل موثوقية لا يتم تصوير الشريان التاجي والجراح يجب أن يقدر فيها لوضع الخيط 15. على الرغم من أن التشريح العام من الأوعية الدموية التاجية هو نفسه، وتقلب الحيوان الفردي في اتجاه والمتفرعة من LAD موجود 16. وهكذا، عندما "تسير في الأعمى،" الشريان يمكن أن تضيع بسهولة. ثم يطلب من التقنيات الأخرى مثل تخطيط صدى القلب لتأكيد الحث الناجح لMI، وضمان جميع العمليات الجراحية تؤدي إلى حجم احتشاء مماثل. ووصف هنا تحسنا على طريقة نشر مؤخرا 15، حيث موقف LAD يمكن إنشقد يكون ligated أسسنا وبالتالي LAD للحث على بتكاثر MI.
لا يتطلب هذا الأسلوب التنبيب الرغامي أو التهوية الميكانيكية، وبضع الصدر في حالة تخفيض درجات الحراره في الماوس حديثي الولادة لا يؤدي إلى انهيار الرئة. ومع ذلك، في الطريقة الموصوفة سابقا، يجب أن يتسبب انخفاض درجة الحرارة الشديد لدرجة كل من توقف التنفس أثناء كاملة ووقف إيقاع القلب 15. الحد الرئيسي لهذا النهج هو أن الشريان التاجي لم يعد perfused ويظهر القلب شاحب حتى قبل LAD ربط. في نهج الموصوفة هنا، والتصور الشريان التاجي هو ممكن في لحظة من سبات قبل انخفاض حرارة الجسم عميق والقلب وقف الإيقاع، مع الشفاء التام من الماوس حديثي الولادة بعد الجراحة. هذا الأسلوب يوفر ميزة كبيرة من 100٪ التكاثر.
Protocol
Representative Results
Discussion
وربط LAD الجراحية أثبتت هنا هو طريقة يمكن الاعتماد عليها لإنتاج MI في الفئران حديثي الولادة. يوفر هذا النموذج باحثين نماذج قابلة للتكرار مع الذي لدراسة تجديد قلب الثدييات. تصور من الأوعية الدموية التاجية هو مكون رئيسي لهذا الأسلوب، وضمان الصحيح وضع خياطة وبالتالي ضمان…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by an operating grant from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) to Q.F. (grant #MOP-119600).
Materials
| 8-0 Nylon Suture | Microsurgery Instruments | 8-0 Nylon | |
| 11-0 Nylon Suture | Shanghai Pudong Medical Products Co Ltd | H1101 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Small forceps | Fine Science Tools | 11063-07 | |
| Micro Needle Holder | Fine Science Tools | 12060-02 | |
| Zeiss Opmi 6s/S3 Microscope | Zeiss | 300002 | |
| Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
| Isoflurane Chamber | Made in Feng laboratory | ||
| Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| 2,3,5-Triphenyltetraolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | |
| Stereomicroscope SteREO Discovery. V8 | Zeiss | 435400 | |
| AxioVision 8.0 | Zeiss | ||
| Axiocam Icc5 | Zeiss | 426554 | |
| Heat pad | Sunbeam | 731A0-CN | |
| Sterile Gloves | VWR | 414004-430 | |
| Gauze Sponges | Ducare | 90212 | |
| Ice |
Riferimenti
- Rosamond, W., et al. Heart disease and stroke statistics–2008 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 117 (4), 25-146 (2008).
- . Meta-analysis Global Group in Chronic Heart Failure. The survival of patients with heart failure with preserved or reduced left ventricular ejection fraction: an individual patient data meta-analysis. Eur Heart J. 33 (14), 1750-1757 (2012).
- Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am J Physiol. 272, 220-226 (1997).
- D’Uva, G., et al. ERBB2 triggers mammalian heart regeneration by promoting cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nat Cell Biol. 17 (5), 627-638 (2015).
- Oberpriller, J. O., Oberpriller, J. C. Response of the adult newt ventricle to injury. J Exp Zool. 187 (2), 249-253 (1974).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).
- Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Haubner, B. J., et al. Complete cardiac regeneration in a mouse model of myocardial infarction. Aging. 4 (12), 966-977 (2012).
- Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development. Am J Physiol. 271, 2183-2189 (1996).
- Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J Mol Cell Cardiol. 28 (8), 1737-1746 (1996).
- Feng, Q., et al. Elevation of an endogenous inhibitor of nitric oxide synthesis in experimental congestive heart failure. Cardiovasc Res. 37 (3), 667-675 (1998).
- Xiang, F. L., et al. Cardiomyocyte-specific overexpression of human stem cell factor improves cardiac function and survival after myocardial infarction in mice. Circulation. 120 (12), 1065-1074 (2009).
- van Kats, J. P., et al. Angiotensin-converting enzyme inhibition and angiotensin II type 1 receptor blockade prevent cardiac remodeling in pigs after myocardial infarction: role of tissue angiotensin II. Circulation. 102 (13), 1556-1563 (2000).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nat Protoc. 9 (2), 305-311 (2014).
- Ahn, D., et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), 1201-1207 (2004).
- Kao, W. W., Xia, Y., Liu, C. Y., Saika, S. Signaling pathways in morphogenesis of cornea and eyelid. Ocul Surf. 6 (1), 9-23 (2008).
- Redfors, B., Shao, Y. Z., Omerovic, E. Myocardial infarct size and area at risk assessment in mice. Experimental & Clinical Cardiology. 17 (4), 268-272 (2012).
- Phifer, C. B., Terry, L. M. Use of hypothermia for general anesthesia in preweanling rodents. Physiol Behav. 38 (6), 887-890 (1986).
- Jesty, S. A., et al. c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (33), 13380-13385 (2012).
- Mahmoud, A. I., et al. Meis1 regulates postnatal cardiomyocyte cell cycle arrest. Nature. 497 (7448), 249-253 (2013).
