Una strategia rapido per l'isolamento di nuovi Faustoviruses da campioni ambientali Utilizzando<em> vermiformis Vermamoeba</em
Summary
We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.
Abstract
L'isolamento del virus giganti è di grande interesse in questa nuova era di virologia, soprattutto perché questi virus giganti sono legati alla protisti. i virus giganti possono essere potenzialmente patogeni per molte specie di protisti. Essi appartengono all'ordine recentemente descritto di Megavirales. La nuova stirpe Faustovirus che è stato isolato da campioni di acque reflue è lontano parente del virus della peste suina africana mammiferi patogeno. Questo virus è anche specifico per il suo ospite amoebal, vermiformis Vermamoeba, un protista comune nei sistemi idrici sanitari. E 'fondamentale continuare a isolare nuovi genotipi Faustovirus al fine di ampliare la sua collezione genotipo e studiare la sua pan-genoma. Abbiamo sviluppato nuove strategie per l'isolamento di ceppi supplementari migliorando l'uso di combinazioni di antibiotici e antifungini per evitare contaminazioni batteriche e fungine della co-coltura amebe e favorendo la moltiplicazione del virus. Abbiamo anche implementato un nuovo starvation medio di mantenere V. vermiformis in condizioni ottimali per i virus co-coltura. Infine, abbiamo utilizzato la citometria a flusso anziché osservazione microscopica, che richiede tempo, per rilevare l'effetto citopatico. Abbiamo ottenuto due isolati da campioni di depurazione, dimostrando l'efficacia di questo metodo e ampliando così la raccolta di Faustoviruses, per capire meglio il loro ambiente, specificità dell'ospite e contenuto genetico.
Introduction
La scoperta del virus giganti, specialmente quelli appartenenti all'ordine Megavirales, completamente cambiato il mondo dei virus in termini di dimensione delle particelle e del genoma complessità. I virus sono stati precedentemente pensato per essere piccole entità, e la mimivirus sembravano rompere tutte le regole. 1 metagenomiche dati suggeriscono l'ubiquità di virus giganti, non solo per l'ambiente, 2-5 ma anche negli esseri umani. 6 Pertanto, non vi è ancora la necessità per la ricerca di questi virus su larga scala. La diversità di questi virus giganti è stata valutata mediante il campionamento non solo una varietà di ambienti acquatici e delle loro sedimenti associati in tutto il mondo, 7-11 ma anche con la proiezione di una serie di campioni umani 12,13 e campioni ambientali. 7,9 I mimivirus Polyphaga Acanthamoeba è stato isolato dal co-coltura con protisti fagocitosi, soprattutto Acanthamoeba spp. 14-16 un'intera collezione di virus giganti sono stati poi ancheisolata da questo host protista specificato, che ha reso la comunità scientifica limitare la sua procedura di ricerca e di isolamento per Acanthamoeba spp. Chiaramente questo affidamento su una singola specie ospite ha portato ad una grande frazione di virus essere trascurato. Il fatto che il virus gigante, CroV, è stato isolato con il altamente mobili marino protozoi Caffetteria roenbergensis, 17,18 dimostra la necessità di utilizzare una gamma più ampia di protozoi, al fine di scoprire nuove linee o famiglie di virus giganti. Reteno et al. Sono riusciti a selezionare altri protozoi come host di cellule che non era mai stato utilizzato in precedenza, e isolato la nuova stirpe Asfar correlati di virus giganti (il nuovo nome Faustovirus). 19
Nel tentativo di isolare nuovi genotipi Faustovirus al fine di espandere i membri di questo lignaggio virale, abbiamo modificato le nostre procedure di isolamento e li hanno usati per lo screening campioni ambientali capaci di raccolta nuovi Faustoviruses. abbiamo poidescritto l'intero protocollo per caratterizzare i nuovi isolati. Abbiamo valutato vermiformis Vermamoeba, il protista a vita libera più comune in ambienti umani, 20-22 che è già utilizzato per l'isolamento del primo prototipo Faustovirus E12. 19 Questo protista è attualmente ancora-host specifico per Faustovirus. Sapevamo che nessuno dei virus noti giganti era patogeni per questa ameba, perché nessun tentativo di crescere altri virus giganti nel nostro laboratorio ha mostrato lisi ameba o la crescita virale. Per questo motivo, riteniamo che V. vermiformis è il migliore e più unico supporto di cellule noto per isolare nuovi Faustoviruses.
Protocol
Representative Results
Discussion
La possibilità che Faustovirus potrebbe essere il primo membro di una nuova famiglia Megavirales vicino al ASFV è stato suggerito da Reteno et al., 19 ma alcune differenze possono ancora essere distinto. Appare chiaro se Faustovirus dovrebbe far parte della famiglia Asfarviridae o se debba invece formare una nuova famiglia virale putativo. Questo problema richiede ulteriori indagini, in particolare, una caratterizzazione più completa della sua morfologia, gamma degli ospiti, ciclo di replicazione …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements to make.
Materials
| LSR FORTESSA cytometer | BD Biosciences | France | 649225B4 |
| TECNAI G2 F20 | FEI | Germany | 5027/11 |
| Optical inverted microscope | leica | France | 72643 |
| DNA extraction | Qiagen EZ1 Advanced XL Extraction Robot | France | L106A0452 |
| PCR Cycler CFX96 | Bio rad | France | 785BR06298 |
| PYG medium , PAS, Starvation medium | In house laboratory production | Marseille URMITE | x |
| Amoeba strain CDC-19 | ATCC | France | 50237 |
| Plates | Cellstar | France | 655180 |
| PCR materials, primers. | eurogentec | France | Primers cited in manuscript |
| glasstic slide 10 with grids | Kova | USA | H899871441F |
| Eosin/ blue Azur-Hemacolor stain | Merck milipore | France | 111955,6,57,109468 |
| Vacuum driven filters | Thermo scientific | France | BPV4550 / 20170115 |
| Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher scientific | France | 10010-023 |
| DAPI stain | Life Technologies | France | D1306 |
| cytospin 4 cytocentrifuge | Thermo Fisher scientific | France | 10522013JT184-31 |
| Single cytology tunnel | Biomedical polymers inc. | France | BMP-cyto-S50 |
| Carbon grids | Euromedex | France | FCF400NI |
| Ammonium molibdate | VWR internationanl | France | 21276185 |
| Flasks | SARSTEDT | Germany | 833911 |
| 0.22μm filters | Milex millipor | France | SE2M229104 |
| Ultracentrifuge Sorval WX 80 | Thermo scientific | France | 9102448 |
| Rapid-flow filters | Nalgene | France | 450-0020 |
Riferimenti
- Raoult, D., et al. The 1.2-megabase genome sequence of Mimivirus. Science. 306 (5700), 1344-1350 (2004).
- Claverie, J. -. M. Giant viruses in the oceans: the 4th Algal Virus Workshop. Virol J. 2, 52-52 (2004).
- Monier, A. A., et al. Marine mimivirus relatives are probably large algal viruses. Audio, Transactions of the IRE Professional Group on. 5, 12-12 (2007).
- Monier, A., Claverie, J. M., Ogata, H. Taxonomic distribution of large DNA viruses in the sea. Genome Biol. , (2008).
- Claverie, J. -. M., et al. Mimivirus and Mimiviridae: Giant viruses with an increasing number of potential hosts, including corals and sponges. J Invertebr Pathol. 101 (3), 9-9 (2009).
- Colson, P., et al. Evidence of the megavirome in humans. J Clin Virol. 57 (3), 191-200 (2013).
- La Scola, B., et al. Tentative characterization of new environmental giant viruses by MALDI-TOF mass spectrometry. Intervirology. 53 (5), 344-353 (2010).
- Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environ Microbiol. , (2012).
- Pagnier, I., et al. A decade of improvements in mimiviridae and marseilleviridae isolation from amoeba. Intervirology. 56 (6), 354-363 (2012).
- Philippe, N., et al. Pandoraviruses: Amoeba Viruses with Genomes Up to 2.5 Mb Reaching That of Parasitic Eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
- Legendre, M., et al. Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology. PNAS. , (2014).
- Saadi, H., et al. First Isolation of Mimivirus in a Patient With Pneumonia. Clin Infect Dis. , (2013).
- Saadi, H., et al. Shan virus: a new mimivirus isolated from the stool of a Tunisian patient with pneumonia. Intervirology. 56 (6), 424-429 (2013).
- Claverie, J. -. M., Abergel, C. Mimivirus: the emerging paradox of quasi-autonomous viruses. Trends Genet : TIG. 26 (10), 431-437 (2010).
- Colson, P., et al. Viruses with more than 1,000 genes: Mamavirus, a new Acanthamoeba polyphaga mimivirus strain, and reannotation of Mimivirus genes. Genome Biol Evol. 3, 737-742 (2010).
- Claverie, J. -. M., Abergel, C. Open questions about giant viruses. Adv Virus Res. 85, 25-56 (2013).
- Fischer, M. G. M., Allen, M. J. M., Wilson, W. H. W., Suttle, C. A. C. Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton. PNAS. 107 (45), 19508-19513 (2010).
- Van Etten, J. L. Another really, really big virus. Viruses. 3 (1), 32-46 (2011).
- Reteno, D. G., et al. Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae. J.Virol. , (2015).
- Coşkun, K. A., Ozçelik, S., Tutar, L., Elaldı, N., Tutar, Y. Isolation and identification of free-living amoebae from tap water in Sivas, Turkey. Biomed res Int. 2013, 675145 (2013).
- Bradbury, R. S. Free-living amoebae recovered from human stool samples in Strongyloides agar culture. J Clin microbiol. 52 (2), 699-700 (2014).
- Pagnier, I., Valles, C., Raoult, D., La Scola, B. Isolation of Vermamoeba vermiformis and associated bacteria in hospital water. Microb Pathog. 80, 14-20 (2015).
- Ogata, H., Toyoda, K., et al. Remarkable sequence similarity between the dinoflagellate-infecting marine girus and the terrestrial pathogen African swine fever virus. Virol J. 6, 178-178 (2008).
- Tarutani, K., Nagasaki, K., Itakura, S. Isolation of a virus infecting the novel shellfish-killing dinoflagellate Heterocapsa circularisquama. Aquat Microb Ecol. 23, 103-111 (2001).
