Een microfluïdische platform voor High-throughput Single-cell Isolatie en Cultuur
Summary
Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.
Abstract
Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.
Introduction
Momenteel plaatsen enkele cellen afzonderlijk in een kweekruimte wordt gewoonlijk bereikt door beperkende verdunning of fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Voor veel laboratoria beperkende verdunning een geschikte methode, aangezien het slechts vereist een pipet en weefselkweek platen, die gemakkelijk beschikbaar zijn. In dit geval wordt een celsuspensie serieel verdund tot een geschikte celdichtheid, en vervolgens in cultuur putjes geplaatst met een manuele pipet. Deze compartimenten enkele cellen worden vervolgens gebruikt voor cellulaire analyse, zoals genetische heterogeniteit screenen 1 en 2 kolonievorming. Deze methode is low-throughput en arbeidsintensief, zonder gebruikmaking van een robotarm om bijstand omdat de Poisson verdeling aard van de beperkende verdunningsmethode beperkt eencellige events een maximale waarschijnlijkheid van 37% 3. FACS machines met een geïntegreerde robotarm kan de beperking van de Poisson-verdeling overwonnen door nauwkeurig placing een single-cell in een cultuur goed in een tijd 4. De hoge schuifspanning mechanische (dus verminderde cellevensvatbaarheid) 5 en machine aankoop en bedrijfskosten hebben het gebruik ervan beperkt in veel laboratoria.
Om de bovenstaande beperkingen te overwinnen, zijn microschaal apparaten zijn ontwikkeld om zeer efficiënt enkele cellen in microwells 6 laden. Echter, de microputjes niet voldoende ruimte voor het beladen cellen prolifereren, vanwege de noodzaak om de grootte van elk microputje dicht bij die van een enkele cel om de eencellige loading waarschijnlijkheid maximaliseren. Aangezien cultuur assays vereist in veel cellen gebaseerde toepassingen (bijvoorbeeld klonogene assay 7), grotere microputjes (90-650 pm in diameter of lengte) zijn ook gebruikt om langere celculturen. Echter, zoals de beperkende verdunning methode, ze bezitten ook low single cell laden efficiëntie, variërend van 10 -. 30% 8, 9
Eerder hebben we een high-throughput microfluïdische platform ontwikkeld om enkele cellen te isoleren in afzonderlijke microwells en tonen de toepassing ervan in klonogene assay van de geïsoleerde cellen. 10 De inrichting werd gemaakt met polydimethylsiloxaan (PDMS) en omvat twee stellen microputje arrays microwell met verschillende afmetingen, die grotendeels de efficiëntie van het laden van een enkele cel in een microtiterplaat waarvan de grootte kan verbeteren is aanzienlijk groter dan de cel. Met name de "dual-well" concept maakt de grootte van de kweek gebied flexibel worden aangepast zonder dat de eencellige capture efficiency, waardoor het eenvoudig om de vormgeving van de inrichting aan te passen aan verschillende celtypen en toepassingen. Deze high-efficiency methode moet nuttig zijn voor de lange termijn celkweek experimenten voor mobiele heterogeniteit studies en monoklonale cellijn vestiging.
Protocol
Representative Results
Discussion
-Microwell-apparaat systemen 6,14 werden gebruikt voor single-cell bewerking en analyse, zoals grootschalige eencellige trapping 6 en één hematopoietische stamcel proliferatie 15. Hoewel goed grootte, aantal en vorm kan worden aangepast voor specifieke toepassingen, de eencellige isoleerrendement altijd gevaar wanneer de grootte van de put toeneemt. 9,15
Om deze beperking te overwinnen, Park et al. Rapporteerde een microfluïdische chip …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the National Health Research Institutes (03-A1 BNMP11-014).
Materials
| AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
| Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
| Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
| Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
| SU-8 50 negative photoresist | MicroChem | Y131269 | |
| SU-8 100 negative photoresist | MicroChem | Y131273 | |
| Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
| Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
| Scanning laser profilometer | KEYENCE | VK-X 100 | |
| Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | TRIDECAFLUORO-1,1,2,2-TETRAHYDROOCTYL. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract., reacts violently with water. |
| Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | SPACE SAVER VACUUM DESICCATOR 190MM WHITE BASE |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15072 | with 0.75 mm inner-diameter |
| Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bersing Technology | ALB001.500 | |
| DMEM basal medium | Gibco | 12800-017 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Hyclone | SH30071.03HI | |
| Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
| Recombinant enzyme mixture | Innovative cell technology | AM-105 | Accumax |
| DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
| Plastic syringe (1 mL) | BD Biosciences | 309659 | |
| 23 gauge blunt needles | Ever Sharp Technology, Inc. | TD21 | |
| Poly-tetrafluoroethene (PTFE) tubing | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |
Riferimenti
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Vermeulen, L., et al. Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity. P Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).
- Shapiro, H. M. . Practical flow cytometry. , (2005).
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single adult stem cell. Nature. 456 (7223), 804-808 (2008).
- Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science. Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).
- Rettig, J. R., Folch, A. Large-scale single-cell trapping and imaging using microwell arrays. Anal. Chem. 77 (17), 5628-5634 (2005).
- Liu, J., et al. Soft fibrin gels promote selection and growth of tumorigenic cells. Nat Mater. 11 (8), 734-741 (2012).
- Charnley, M., Textor, M., Khademhosseini, A., Lutolf, M. P. Integration column: microwell arrays for mammalian cell culture. Integr. Biol. 1 (11-12), 11-12 (2009).
- Lindstrom, S., et al. High-density microwell chip for culture and analysis of stem cells. PloS one. 4 (9), e6997 (2009).
- Lin, C. H., et al. A microfluidic dual-well device for high-throughput single-cell capture and culture. Lab Chip. 15 (14), 2928-2938 (2015).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angew Chem Int Edit. 37 (5), 550-575 (1998).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).
- Lindstrom, S., Andersson-Svahn, H. Miniaturization of biological assays – Overview on microwell devices for single-cell analyses. Bba-Gen Subjects. 1810 (3), 308-316 (2011).
- Lecault, V., et al. High-throughput analysis of single hematopoietic stem cell proliferation in microfluidic cell culture arrays. Nat Methods. 8 (7), 581-593 (2011).
- Park, J. Y., et al. Single cell trapping in larger microwells capable of supporting cell spreading and proliferation. Microfluid Nanofluid. 8 (2), 263-268 (2010).
- Tirino, V., et al. Cancer stem cells in solid tumors: an overview and new approaches for their isolation and characterization. FASEB J. 27 (1), 13-24 (2013).
- Chen, P. C., Huang, Y. Y., Juang, J. L. MEMS microwell and microcolumn arrays: novel methods for high-throughput cell-based assays. Lab Chip. 11 (21), 3619-3625 (2011).
- Liang, P., et al. Drug Screening Using a Library of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Reveals Disease-Specific Patterns of Cardiotoxicity. Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).
