Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.
Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.
वर्तमान में एक संस्कृति अंतरिक्ष में व्यक्तिगत रूप से एकल कक्षों रखने आमतौर पर सीमित कमजोर पड़ने या प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) का उपयोग करके हासिल की है। कई प्रयोगशालाओं के लिए, कमजोर पड़ने सीमित, एक सुविधाजनक तरीका है, क्योंकि यह केवल एक पिपेट और टिशू कल्चर प्लेटें, जो आसानी से उपलब्ध हैं की आवश्यकता है। इस मामले में, एक सेल निलंबन क्रमानुसार एक उपयुक्त सेल घनत्व को पतला है, और फिर एक मैनुअल पिपेट का उपयोग करके संस्कृति कुओं में रखा। ये compartmented एकल कक्षों तो ऐसे आनुवंशिक विविधता 1 और 2 कॉलोनी गठन स्क्रीनिंग के रूप में, सेल विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है। हालांकि, इस विधि क्योंकि सीमित कमजोर पड़ने विधि के पॉसों वितरण प्रकृति 37% 3 की अधिकतम संभावना करने के लिए एकल कोशिका घटनाओं प्रतिबंधित, कम throughput और श्रम प्रधान, सहायता के लिए एक रोबोट भुजा के उपयोग के बिना है। एक एकीकृत रोबोट भुजा के साथ FACS मशीनों सही Plac द्वारा पॉसों वितरण की सीमा को पार कर सकते हैंएक समय 4 में एक संस्कृति में अच्छी तरह से एक एकल कोशिका हैैं। हालांकि, उच्च यांत्रिक कतरनी तनाव (इस प्रकार, सेल व्यवहार्यता उतारा) 5 और मशीन खरीद और परिचालन लागत को कई प्रयोगशालाओं में इसके उपयोग सीमित है।
ऊपर सीमाओं को पार करने के लिए, microscale उपकरणों अत्यधिक कुशलता microwells 6 में एकल कक्षों लोड करने के लिए विकसित किया गया है। हालांकि, microwells पर्याप्त जगह भरी हुई कोशिकाओं को पैदा करने के लिए, प्रत्येक का आकार बनाने के लिए एक एकल कोशिका के करीब microwell एकल कोशिका लोडिंग संभावना को अधिकतम करने की जरूरत के कारण प्रदान नहीं करते। के रूप में संस्कृति assays के कई सेल आधारित अनुप्रयोगों (जैसे, clonogenic परख 7), बड़ा microwells में आवश्यक हैं (90 से – व्यास में या पक्ष लंबाई में 650 माइक्रोन) भी विस्तारित सेल संस्कृतियों के लिए अनुमति देने के लिए उपयोग किया गया है। हालांकि, सीमित कमजोर पड़ने विधि की तरह, वे भी कम एकल कक्ष लोडिंग क्षमता के अधिकारी, 10 से लेकर -। 30% 89
इससे पहले, हम व्यक्तिगत microwells में एकल कक्षों को अलग और अलग कक्षों की clonogenic परख में अपने आवेदन प्रदर्शित करने के लिए एक उच्च throughput microfluidic मंच विकसित किया है। 10 डिवाइस पाली dimethylsiloxane (PDMS) के साथ बनाया गया था, और microwell सरणियों के दो सेट शामिल अलग microwell आकार, जो मोटे तौर पर एक microwell जिसका आकार में एक एकल कोशिका लोड में दक्षता में सुधार कर सकते हैं के साथ सेल की तुलना में काफी बड़ा है। विशेष रूप से, इस "दोहरे अच्छी तरह से" अवधारणा संस्कृति क्षेत्र का आकार लचीले ढंग से एकल कोशिका कब्जा दक्षता को प्रभावित कर रहा है, यह सीधा विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं और अनुप्रयोगों के अनुरूप करने के लिए डिवाइस के डिजाइन को समायोजित करने के लिए बनाने के बिना समायोजित करने की अनुमति देता है। इस उच्च दक्षता विधि सेल विविधता के अध्ययन और मोनोक्लोनल सेल लाइन स्थापना के लिए लंबी अवधि के सेल संस्कृति प्रयोगों के लिए उपयोगी होना चाहिए।
Microwell आधारित डिवाइस सिस्टम 6,14 ऐसे बड़े पैमाने पर एकल कक्ष 6 फँसाने और एकल hematopoietic स्टेम सेल प्रसार के रूप में 15 एकल कोशिका हेरफेर और विश्लेषण के लिए उपयोग किया गया है। हालांकि अच्छी तरह से आकार, सं…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a grant from the National Health Research Institutes (03-A1 BNMP11-014).
AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
SU-8 50 negative photoresist | MicroChem | Y131269 | |
SU-8 100 negative photoresist | MicroChem | Y131273 | |
Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
Scanning laser profilometer | KEYENCE | VK-X 100 | |
Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | TRIDECAFLUORO-1,1,2,2-TETRAHYDROOCTYL. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract., reacts violently with water. |
Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | SPACE SAVER VACUUM DESICCATOR 190MM WHITE BASE |
Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15072 | with 0.75 mm inner-diameter |
Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Bersing Technology | ALB001.500 | |
DMEM basal medium | Gibco | 12800-017 | |
Fetal bovine serum | Thermo Hyclone | SH30071.03HI | |
Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
Recombinant enzyme mixture | Innovative cell technology | AM-105 | Accumax |
DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
Plastic syringe (1 mL) | BD Biosciences | 309659 | |
23 gauge blunt needles | Ever Sharp Technology, Inc. | TD21 | |
Poly-tetrafluoroethene (PTFE) tubing | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |