Una piattaforma Microfluidic per l'isolamento Single-cell high-throughput e cultura
Summary
Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.
Abstract
Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.
Introduction
Attualmente posizionando le celle singole singolarmente in uno spazio culturale è comunemente raggiunto utilizzando la diluizione limitando o cella a fluorescenza-attivato (FACS). Per molti laboratori, diluizione limite è un metodo conveniente, in quanto richiede solo una pipetta e piastre di coltura di tessuto, che sono prontamente disponibili. In questo caso, una sospensione cellulare viene diluito serialmente ad una densità cellulare appropriata, e quindi posto in pozzetti di coltura utilizzando una pipetta manuale. Queste cellule singoli compartimenti sono poi utilizzati per l'analisi delle cellule, come ad esempio lo screening eterogeneità genetica 1 e colonia di formazione 2. Tuttavia, questo metodo è basso throughput e intensità di lavoro, senza utilizzare un braccio robotico per l'assistenza, perché la natura distribuzione di Poisson del metodo di diluizione limitante limita eventi monocellulari ad una probabilità massima del 37% 3. macchine FACS con un braccio robotico integrato in grado di superare la limitazione della distribuzione di Poisson con precisione placing una singola cella in una cultura ben alla volta 4. Tuttavia, l'elevato sforzo di taglio meccanico (quindi abbassato vitalità cellulare) 5 ed acquisto della macchina e dei costi operativi hanno limitato il suo utilizzo in molti laboratori.
Per superare le limitazioni di cui sopra, i dispositivi microscala sono stati sviluppati per caricare altamente efficiente singole cellule nei pozzetti 6. Tuttavia, i pozzetti non forniscono spazio sufficiente per le cellule caricate a proliferare, a causa della necessità di rendere le dimensioni di ciascun pozzetto vicino a quello di una singola cella di massimizzare il carico probabilità cella singola. Come test di cultura sono necessari in molte applicazioni basati su celle (ad esempio, test clonogenica 7), pozzetti più grandi (90-650 micron di diametro o in lunghezza del lato) sono stati utilizzati per consentire colture cellulari estesi. Tuttavia, come il metodo di diluizione limitante, possiedono anche bassi singole efficienze di carico delle cellule, che vanno da 10 -. 30% 8, 9
In precedenza, abbiamo sviluppato una piattaforma microfluidica high-throughput per isolare singole cellule nei singoli pozzetti e dimostrare la sua applicazione nel saggio clonogenica delle cellule isolate. 10 Il dispositivo è stato realizzato con poli-dimetilsiloxano (PDMS), e comprende due serie di array di pozzetti con differenti formati micropozzetti, che può sostanzialmente migliorare l'efficienza nel caricare una singola cella in un micropozzetto cui dimensione è significativamente più grande della cella. In particolare, questo concetto "dual-well" permette la dimensione dell'area culturale di regolare in modo flessibile senza compromettere l'efficienza di cattura cella singola, rendendo semplice per regolare la progettazione del dispositivo per soddisfare diversi tipi di cellule e applicazioni. Questo metodo ad alta efficienza dovrebbe essere utile per esperimenti di coltura cellulare a lungo termine per gli studi eterogeneità delle cellule e monoclonale stabilimento linea cellulare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sistemi di dispositivi di pozzetti a base di 6,14 sono stati utilizzati per la manipolazione a cella singola e di analisi, come ad esempio su larga scala singola cellula intrappolando 6 e la proliferazione delle cellule staminali ematopoietiche singolo 15. Sebbene dimensioni ben, il numero e la forma può essere regolata per applicazioni specifiche, l'efficienza di isolamento singola cella è sempre compromessa quando si aumenta la dimensione del pozzo. 9,15
<p class="…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the National Health Research Institutes (03-A1 BNMP11-014).
Materials
| AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
| Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
| Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
| Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
| SU-8 50 negative photoresist | MicroChem | Y131269 | |
| SU-8 100 negative photoresist | MicroChem | Y131273 | |
| Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
| Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
| Scanning laser profilometer | KEYENCE | VK-X 100 | |
| Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | TRIDECAFLUORO-1,1,2,2-TETRAHYDROOCTYL. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract., reacts violently with water. |
| Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | SPACE SAVER VACUUM DESICCATOR 190MM WHITE BASE |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15072 | with 0.75 mm inner-diameter |
| Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bersing Technology | ALB001.500 | |
| DMEM basal medium | Gibco | 12800-017 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Hyclone | SH30071.03HI | |
| Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
| Recombinant enzyme mixture | Innovative cell technology | AM-105 | Accumax |
| DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
| Plastic syringe (1 mL) | BD Biosciences | 309659 | |
| 23 gauge blunt needles | Ever Sharp Technology, Inc. | TD21 | |
| Poly-tetrafluoroethene (PTFE) tubing | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |
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