높은 처리량 단일 세포의 분리 및 문화를위한 미세 유체 플랫폼
Summary
Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.
Abstract
Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.
Introduction
현재 배양 공간에 개별적으로 하나의 셀을 배치는 일반적으로 제한 희석 또는 형광 – 활성화 된 세포 분류 (FACS)를 사용하여 달성된다. 그것은 단지 쉽게 사용할 수 있습니다 피펫 및 조직 배양 플레이트를 필요로 많은 실험실의 경우, 희석을 제한하는 편리한 방법입니다. 이러한 경우에, 세포 현탁액을 연속적으로 적당한 세포 밀도로 희석 한 다음 수동 피펫을 이용하여 배양 웰에 두었다. 이러한 복실 단셀 그런 다음 1 콜로니 형성이 스크리닝 이질성 유전자로서 세포 분석을 위해 사용된다. 한계 희석법의 푸 아송 분포의 특성은 37 % (3)의 최대 확률 단세포 이벤트를 제한하기 때문에,이 방법을 지원하기위한 로봇 팔을 이용하지 않고 낮은 처리량과 노동력이있다. 통합 된 로보트 팔 FACS 기계 정확하게 PLAC으로 푸 아송 분포의 한계를 극복 할 수있다한 번에 4에서 잘 문화에서 하나의 셀을 보내고. 그러나, 높은 기계적 전단 응력은 5 (따라서, 세포 생존 능력을 저하) 및 기계 구입 및 운영 비용은 많은 실험실에서의 사용을 제한하고있다.
고효율 마이크로 웰 (6)에 하나의 셀을로드에 위의 한계를 극복하기 위해, 마이크로 장치가 개발되었다. 그러나, 마이크로 웰은로드 셀 인해 단일 셀 로딩 가능성을 최대화하기 위해 하나의 셀에 가까운 마이크로 웰 각의 크기의 제조가 필요로 증식 할 충분한 공간을 제공하지 않는다. 배양 분석이 더 많은 마이크로 웰 세포 – 기반 애플리케이션 (예를 들면, 클론 원성 분석 7)에 요구되는 바와 같이 (90 – 650 ㎛의 직경 또는 측면 길이) 또한 확장 세포 배양을 허용하기 위해 이용되어왔다. 그러나, 한계 희석법 같이, 또한 (10)에 이르기까지, 낮은 단일 셀 로딩 효율을 갖는다 -. 30 % 89
이전에, 우리는 (10) 장치는 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)으로 제작 하였다. 각각의 마이크로 웰에서 단일 세포를 분리하고, 분리 된 세포의 클론 원성 분석에서의 응용을 증명하기 위해 높은 처리량 미세 플랫폼을 개발하고, 마이크로 웰 어레이들의 두 세트를 포함하는 한 대체로 크기가 마이크로 웰의 단일 셀 로딩의 효율을 향상시킬 수있는 다른 마이크로 웰 크기와 세포보다 상당히 크다. 특히,이 "이중 – 웰"개념 배양 영역의 크기는 유동적이 간단 다른 세포 유형 및 애플리케이션에 적합하도록 장치의 설계를 조정할 수있어 단일 세포 포집 효율에 영향을주지 않고 조절 될 수있다. 이 고효율 방법은 세포 이질성 연구 및 모노클로 날 세포주 확립 장기간 세포 배양 실험에 유용 할 것이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
마이크로 웰 기반 장치 시스템은 6,14 그러한 6 트래핑 대규모 단일 셀 및 단일 조혈 줄기 세포 증식 15 단일 세포 조작 및 분석을 위해 사용되어왔다. 물론 크기, 개수, 형상 비록 특정 애플리케이션을 위해 조절 될 수 있으며, 웰의 크기가 증가 될 때 단일 세포 분리 효율은 항상 노출되어있다. 9,15
마이크로 웰의 크기가 세포의 확산과 성장을 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the National Health Research Institutes (03-A1 BNMP11-014).
Materials
| AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
| Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
| Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
| Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
| SU-8 50 negative photoresist | MicroChem | Y131269 | |
| SU-8 100 negative photoresist | MicroChem | Y131273 | |
| Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
| Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
| Scanning laser profilometer | KEYENCE | VK-X 100 | |
| Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | TRIDECAFLUORO-1,1,2,2-TETRAHYDROOCTYL. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract., reacts violently with water. |
| Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | SPACE SAVER VACUUM DESICCATOR 190MM WHITE BASE |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15072 | with 0.75 mm inner-diameter |
| Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bersing Technology | ALB001.500 | |
| DMEM basal medium | Gibco | 12800-017 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Hyclone | SH30071.03HI | |
| Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
| Recombinant enzyme mixture | Innovative cell technology | AM-105 | Accumax |
| DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
| Plastic syringe (1 mL) | BD Biosciences | 309659 | |
| 23 gauge blunt needles | Ever Sharp Technology, Inc. | TD21 | |
| Poly-tetrafluoroethene (PTFE) tubing | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |
Riferimenti
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