En mikrofluid plattform for High-throughput encellede Isolering og kultur
Summary
Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.
Abstract
Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.
Introduction
For tiden å lage en enkeltceller hver for seg i et kulturområder som vanligvis oppnås ved hjelp av begrensende fortynning eller fluorescens-aktivert cellesortering (FACS). For mange laboratorier, begrensende fortynning er en praktisk metode, da den bare krever en pipette og vevskulturplater, som er lett tilgjengelige. I dette tilfellet blir en cellesuspensjon fortynnet i serie til en passende celletetthet, og deretter plassert inn i kulturbrønnene ved hjelp av en manuell pipette. Disse kammere enkeltceller blir så brukt for celleanalyse, for eksempel genetisk screening heterogenitet 1 og 2 kolonidannelse. Imidlertid er denne metoden lav gjennomstrømming og arbeidskrevende, uten anvendelse av en robotarm for å få hjelp, fordi Poissonfordelingen arten av den begrensende fortynningsmetode begrenser encellede hendelser til et maksimum sannsynlighet på 37% 3. FACS maskiner med integrert robotarm kan overvinne begrensning av Poisson-fordelingen av nøyaktig placing en enkelt-celle i et dyrknings godt om gangen 4. Men høy mekanisk skjærspenning (og dermed senket celleviabilitet) 5 og maskin kjøp og driftskostnader har begrenset bruken i mange laboratorier.
For å overvinne de ovennevnte begrensninger, har mikroskala anordninger blitt utviklet for å høyt effektivt laste enkeltceller inn i mikrobrønner 6. Imidlertid ikke mikrobrønnene ikke gir tilstrekkelig plass for de lastede celler til å proliferere, på grunn av behovet for å gjøre størrelsen på hver mikrobrønn nær den for en enkelt celle for å maksimere den encellede lasting sannsynlighet. Som kultur analysene er nødvendig i mange cellebaserte programmer (for eksempel klonogene analyse 7), større mikrobrønner (90-650 mikrometer i diameter eller i sidelengde) er også blitt anvendt for å gi rom for utvidet cellekulturer. Men, som den begrensende fortynning metoden, de også har lave enkeltcelle lasting effektivitet, alt fra 10 -. 30% 8, 9
Tidligere har vi utviklet en high-throughput mikrofluid plattform for å isolere enkeltceller i enkelte mikrobrønner og demonstrere dens anvendelse i klonogene analyse av de isolerte celler. 10 Anordningen ble gjort med poly-dimetylsiloksan (PDMS), og omfatter to sett av mikro matriser med forskjellige mikro størrelser, som i stor grad kan forbedre effektiviteten i lasting av en enkelt celle i et mikro hvis størrelse er betydelig større enn cellen. Spesielt, kan denne "dual-well" -konseptet størrelsen av kulturen området som skal fleksibelt justeres uten å påvirke den encellede fangsteffektivitet, noe som gjør det enkelt å justere utformingen av enheten for å passe til forskjellige celletyper og anvendelser. Dette høyeffektive metoden skal være nyttig for langsiktig cellekultur eksperimenter for celle heterogenitet studier og monoklonale cellelinje etablering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikrobaserte enhetssystemer 6,14 har blitt benyttet for encellede manipulasjon og analyse, for eksempel i stor skala enkelt celle fangst 6 og enkelt stamcelle spredning 15. Selv om vel størrelse, antall og form kan bli justert for spesielle anvendelser, enkeltcelleisolasjon effektivitet er alltid utsatt når størrelsen av brønnen økes. 9,15
For å overvinne denne begrensningen, Park et al., Rapporterte et mikrofluid brikke med trekante…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the National Health Research Institutes (03-A1 BNMP11-014).
Materials
| AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
| Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
| Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
| Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
| SU-8 50 negative photoresist | MicroChem | Y131269 | |
| SU-8 100 negative photoresist | MicroChem | Y131273 | |
| Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
| Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
| Scanning laser profilometer | KEYENCE | VK-X 100 | |
| Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | TRIDECAFLUORO-1,1,2,2-TETRAHYDROOCTYL. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract., reacts violently with water. |
| Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | SPACE SAVER VACUUM DESICCATOR 190MM WHITE BASE |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15072 | with 0.75 mm inner-diameter |
| Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bersing Technology | ALB001.500 | |
| DMEM basal medium | Gibco | 12800-017 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Hyclone | SH30071.03HI | |
| Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
| Recombinant enzyme mixture | Innovative cell technology | AM-105 | Accumax |
| DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
| Plastic syringe (1 mL) | BD Biosciences | 309659 | |
| 23 gauge blunt needles | Ever Sharp Technology, Inc. | TD21 | |
| Poly-tetrafluoroethene (PTFE) tubing | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |
Riferimenti
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Vermeulen, L., et al. Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity. P Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).
- Shapiro, H. M. . Practical flow cytometry. , (2005).
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single adult stem cell. Nature. 456 (7223), 804-808 (2008).
- Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science. Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).
- Rettig, J. R., Folch, A. Large-scale single-cell trapping and imaging using microwell arrays. Anal. Chem. 77 (17), 5628-5634 (2005).
- Liu, J., et al. Soft fibrin gels promote selection and growth of tumorigenic cells. Nat Mater. 11 (8), 734-741 (2012).
- Charnley, M., Textor, M., Khademhosseini, A., Lutolf, M. P. Integration column: microwell arrays for mammalian cell culture. Integr. Biol. 1 (11-12), 11-12 (2009).
- Lindstrom, S., et al. High-density microwell chip for culture and analysis of stem cells. PloS one. 4 (9), e6997 (2009).
- Lin, C. H., et al. A microfluidic dual-well device for high-throughput single-cell capture and culture. Lab Chip. 15 (14), 2928-2938 (2015).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angew Chem Int Edit. 37 (5), 550-575 (1998).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).
- Lindstrom, S., Andersson-Svahn, H. Miniaturization of biological assays – Overview on microwell devices for single-cell analyses. Bba-Gen Subjects. 1810 (3), 308-316 (2011).
- Lecault, V., et al. High-throughput analysis of single hematopoietic stem cell proliferation in microfluidic cell culture arrays. Nat Methods. 8 (7), 581-593 (2011).
- Park, J. Y., et al. Single cell trapping in larger microwells capable of supporting cell spreading and proliferation. Microfluid Nanofluid. 8 (2), 263-268 (2010).
- Tirino, V., et al. Cancer stem cells in solid tumors: an overview and new approaches for their isolation and characterization. FASEB J. 27 (1), 13-24 (2013).
- Chen, P. C., Huang, Y. Y., Juang, J. L. MEMS microwell and microcolumn arrays: novel methods for high-throughput cell-based assays. Lab Chip. 11 (21), 3619-3625 (2011).
- Liang, P., et al. Drug Screening Using a Library of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Reveals Disease-Specific Patterns of Cardiotoxicity. Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).
