Микрожидком Платформа с высокой пропускной способностью изоляции одноклеточные и культуры
Summary
Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.
Abstract
Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.
Introduction
В настоящее время размещения отдельных клеток по отдельности в ферментационной пространстве обычно достигается за счет использования ограниченного разведения или флуоресценции активированного сортировки клеток (FACS). Для многих лабораторий, предельное разведение является удобным методом, так как он требует только пипеткой и тканевые культуры пластины, которые легко доступны. В этом случае суспензию клеток серийно разводили до соответствующей плотности клеток, и затем помещают в культуральные лунки с помощью ручной пипетки. Эти отдельные клетки , разделенные на отсеки, затем используются для анализа клеток, таких как генетической гетерогенности скрининг 1 и колонии образование 2. Тем не менее, этот метод является низкой пропускной способностью и трудоемкий, без использования роботизированную руку за помощью, так как распределение Пуассона характер методом серийных разведений ограничивает события одноклеточных до максимальной вероятностью 37% 3. FACS машины с интегрированной роботизированной рукой может преодолеть ограничение распределения Пуассона путем точного НОАКING один для одной ячейки в культуре также одновременно 4. Тем не менее, высокие механические напряжения сдвига (таким образом, снижение жизнеспособности клеток) 5 и машина покупка и эксплуатационные расходы ограничили его использование во многих лабораториях.
Чтобы преодолеть вышеуказанные ограничения, микромасштабные устройства были разработаны с высокой эффективностью загрузки отдельных клеток в лунках 6. Тем не менее, Микролунки не обеспечивают достаточное пространство для нагруженные клетки к пролиферации, из-за необходимости делать размер каждого микропланештным, близкой к одной ячейке, чтобы максимизировать вероятность загрузки одноклеточных. Как Анализы культуры необходимы во многих приложениях , основанных на клетках (например, клоногенности 7), более крупные Микролунки (от 90 – 650 мкм в диаметре или по длине боковой) также были использованы для обеспечения расширенных клеточных культур. Тем не менее, как и методом серийных разведений, они также обладают низкой эффективностью одноклеточ- погрузочных, в пределах от 10 -. 30% 8, 9
Ранее мы разработали высокой пропускной микрожидкостных платформу для выделения отдельных клеток в отдельных лунках и демонстрируют свое применение в клоногенности из изолированных клеток. 10 Устройство было сделано с поли-диметилсилоксан (PDMS), и включает в себя два набора микролуночные массивов с различными размерами микролуночные, которые могут в значительной степени улучшить эффективность при загрузке одной ячейки в микропланшета размер которого значительно больше, чем клетки. Следует отметить, что это понятие "двойного хорошо" позволяет размер области культуры, чтобы гибко регулироваться без влияния на эффективность улавливания одноклеточных, что делает его простым для регулировки конструкции устройства в соответствии с различными типами клеток и приложений. Этот метод высокой эффективности должно быть полезным для долгосрочных экспериментов на культуре клеток для исследования клеточной гетерогенности и моноклональное создании клеточной линии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Системы устройств Микропланшетные на основе 6,14 были использованы для манипулирования одноклеточных и анализа, такие как крупномасштабной одной клетки захвата 6 и пролиферации одного гемопоэтических стволовых клеток 15. Несмотря на то, также размер, количество и форм?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the National Health Research Institutes (03-A1 BNMP11-014).
Materials
| AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
| Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
| Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
| Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
| SU-8 50 negative photoresist | MicroChem | Y131269 | |
| SU-8 100 negative photoresist | MicroChem | Y131273 | |
| Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
| Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
| Scanning laser profilometer | KEYENCE | VK-X 100 | |
| Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | TRIDECAFLUORO-1,1,2,2-TETRAHYDROOCTYL. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract., reacts violently with water. |
| Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | SPACE SAVER VACUUM DESICCATOR 190MM WHITE BASE |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15072 | with 0.75 mm inner-diameter |
| Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bersing Technology | ALB001.500 | |
| DMEM basal medium | Gibco | 12800-017 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Hyclone | SH30071.03HI | |
| Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
| Recombinant enzyme mixture | Innovative cell technology | AM-105 | Accumax |
| DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
| Plastic syringe (1 mL) | BD Biosciences | 309659 | |
| 23 gauge blunt needles | Ever Sharp Technology, Inc. | TD21 | |
| Poly-tetrafluoroethene (PTFE) tubing | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |
Riferimenti
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Vermeulen, L., et al. Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity. P Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).
- Shapiro, H. M. . Practical flow cytometry. , (2005).
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single adult stem cell. Nature. 456 (7223), 804-808 (2008).
- Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science. Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).
- Rettig, J. R., Folch, A. Large-scale single-cell trapping and imaging using microwell arrays. Anal. Chem. 77 (17), 5628-5634 (2005).
- Liu, J., et al. Soft fibrin gels promote selection and growth of tumorigenic cells. Nat Mater. 11 (8), 734-741 (2012).
- Charnley, M., Textor, M., Khademhosseini, A., Lutolf, M. P. Integration column: microwell arrays for mammalian cell culture. Integr. Biol. 1 (11-12), 11-12 (2009).
- Lindstrom, S., et al. High-density microwell chip for culture and analysis of stem cells. PloS one. 4 (9), e6997 (2009).
- Lin, C. H., et al. A microfluidic dual-well device for high-throughput single-cell capture and culture. Lab Chip. 15 (14), 2928-2938 (2015).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angew Chem Int Edit. 37 (5), 550-575 (1998).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).
- Lindstrom, S., Andersson-Svahn, H. Miniaturization of biological assays – Overview on microwell devices for single-cell analyses. Bba-Gen Subjects. 1810 (3), 308-316 (2011).
- Lecault, V., et al. High-throughput analysis of single hematopoietic stem cell proliferation in microfluidic cell culture arrays. Nat Methods. 8 (7), 581-593 (2011).
- Park, J. Y., et al. Single cell trapping in larger microwells capable of supporting cell spreading and proliferation. Microfluid Nanofluid. 8 (2), 263-268 (2010).
- Tirino, V., et al. Cancer stem cells in solid tumors: an overview and new approaches for their isolation and characterization. FASEB J. 27 (1), 13-24 (2013).
- Chen, P. C., Huang, Y. Y., Juang, J. L. MEMS microwell and microcolumn arrays: novel methods for high-throughput cell-based assays. Lab Chip. 11 (21), 3619-3625 (2011).
- Liang, P., et al. Drug Screening Using a Library of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Reveals Disease-Specific Patterns of Cardiotoxicity. Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).
