En mikroflödessystem plattform för hög genomströmning Single-cell isolering och kultur
Summary
Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.
Abstract
Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.
Introduction
Närvarande att placera enskilda celler individuellt i ett odlingsutrymme uppnås vanligen genom användning av begränsande utspädning eller fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). För många laboratorier, begränsande utspädning är en lämplig metod, eftersom det endast kräver en pipett och vävnadsodlingsplattor, som är lätt tillgängliga. I detta fall är en cellsuspension serieutspäddes till en lämplig celldensitet, och placerades sedan i odlingsbrunnar med hjälp av en manuell pipett. Dessa fackindelade enstaka celler används sedan för cellanalys, såsom genetisk heterogenitet screening en och kolonibildning två. Emellertid är denna metod låg genomströmning och arbetsintensiv, utan att utnyttja en robotarm för hjälp, eftersom Poisson-fördelningen naturen hos den begränsande spädningsmetoden begränsar encelliga händelser till en maximal sannolikhet för 37% 3. FACS maskiner med en integrerad robotarmen kan övervinna begränsningen av Poisson fördelning av exakt placing en enda cell i en odlingsbrunn vid en tidpunkt 4. Emellertid den höga mekaniska skjuvspänning (sålunda, sänkte cellviabilitet) 5 och maskin inköp och driftskostnader har begränsat dess användning i många laboratorier.
För att övervinna ovanstående begränsningar, har mikroskala anordningar utvecklats till mycket effektivt ladda enstaka celler i mikrobrunnar 6. Emellertid inte mikrobrunnarna inte ge tillräckligt med utrymme för de laddade celler att proliferera, på grund av behovet av att göra storleken på varje mikrobrunn nära den för en enda cell för att maximera enkelcellbelastning sannolikhet. Som kulturanalyser krävs i många cellbaserad tillämpningar (t.ex., klonogena analys 7), större mikrobrunnar (90-650 | j, m i diameter eller i sidans längd) har också använts för att tillåta förlängda cellodlingar. Men liksom den begränsande utspädningsmetoden, de har också låga enkelcelllastningseffektivitet, som sträcker sig från 10 -. 30% 8, 9
Tidigare, har vi utvecklat en hög genomströmning mikroflödes plattform för att isolera enstaka celler i enskilda mikrobrunnar och demonstrerar dess tillämpning i klonogen analys av de isolerade cellerna. 10 Anordningen gjordes med poly-dimetylsiloxan (PDMS), och innefattar två uppsättningar av mikrobrunn arrayer med olika mikro storlekar som till stor del kan förbättra effektiviteten vid lastning en enda cell i en mikro vars storlek är betydligt större än cellen. Notably, ger detta "dual-well" -konceptet storleken på odlings område som ska flexibelt justeras utan att påverka den encelliga infångningseffektivitet, vilket gör det enkelt att justera utformningen av anordningen för att passa olika celltyper och applikationer. Detta högeffektiv metod bör vara användbara för långtidscellodlingsförsök för cell heterogenitet studier och monoklonal cellinje anläggning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikro-baserade utrustningssystem 6,14 har använts för encelliga manipulation och analys, såsom storskaliga enda cell fånga 6 och enda hematopoetisk stamcellstransplantation proliferation 15. Men väl storlek, antal och form kan justeras för specifika tillämpningar, encelliga isolering effektivitet alltid äventyras när storleken av brunnen ökar. 9,15
För att övervinna denna begränsning, Park et al. Rapporterade en mikroflödesch…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the National Health Research Institutes (03-A1 BNMP11-014).
Materials
| AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
| Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
| Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
| Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
| SU-8 50 negative photoresist | MicroChem | Y131269 | |
| SU-8 100 negative photoresist | MicroChem | Y131273 | |
| Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
| Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
| Scanning laser profilometer | KEYENCE | VK-X 100 | |
| Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | TRIDECAFLUORO-1,1,2,2-TETRAHYDROOCTYL. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract., reacts violently with water. |
| Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | SPACE SAVER VACUUM DESICCATOR 190MM WHITE BASE |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15072 | with 0.75 mm inner-diameter |
| Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bersing Technology | ALB001.500 | |
| DMEM basal medium | Gibco | 12800-017 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Hyclone | SH30071.03HI | |
| Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
| Recombinant enzyme mixture | Innovative cell technology | AM-105 | Accumax |
| DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
| Plastic syringe (1 mL) | BD Biosciences | 309659 | |
| 23 gauge blunt needles | Ever Sharp Technology, Inc. | TD21 | |
| Poly-tetrafluoroethene (PTFE) tubing | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |
Riferimenti
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Vermeulen, L., et al. Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity. P Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).
- Shapiro, H. M. . Practical flow cytometry. , (2005).
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single adult stem cell. Nature. 456 (7223), 804-808 (2008).
- Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science. Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).
- Rettig, J. R., Folch, A. Large-scale single-cell trapping and imaging using microwell arrays. Anal. Chem. 77 (17), 5628-5634 (2005).
- Liu, J., et al. Soft fibrin gels promote selection and growth of tumorigenic cells. Nat Mater. 11 (8), 734-741 (2012).
- Charnley, M., Textor, M., Khademhosseini, A., Lutolf, M. P. Integration column: microwell arrays for mammalian cell culture. Integr. Biol. 1 (11-12), 11-12 (2009).
- Lindstrom, S., et al. High-density microwell chip for culture and analysis of stem cells. PloS one. 4 (9), e6997 (2009).
- Lin, C. H., et al. A microfluidic dual-well device for high-throughput single-cell capture and culture. Lab Chip. 15 (14), 2928-2938 (2015).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angew Chem Int Edit. 37 (5), 550-575 (1998).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).
- Lindstrom, S., Andersson-Svahn, H. Miniaturization of biological assays – Overview on microwell devices for single-cell analyses. Bba-Gen Subjects. 1810 (3), 308-316 (2011).
- Lecault, V., et al. High-throughput analysis of single hematopoietic stem cell proliferation in microfluidic cell culture arrays. Nat Methods. 8 (7), 581-593 (2011).
- Park, J. Y., et al. Single cell trapping in larger microwells capable of supporting cell spreading and proliferation. Microfluid Nanofluid. 8 (2), 263-268 (2010).
- Tirino, V., et al. Cancer stem cells in solid tumors: an overview and new approaches for their isolation and characterization. FASEB J. 27 (1), 13-24 (2013).
- Chen, P. C., Huang, Y. Y., Juang, J. L. MEMS microwell and microcolumn arrays: novel methods for high-throughput cell-based assays. Lab Chip. 11 (21), 3619-3625 (2011).
- Liang, P., et al. Drug Screening Using a Library of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Reveals Disease-Specific Patterns of Cardiotoxicity. Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).
