Yüksek verim Tek hücreli İzolasyonu ve Kültür mikroakışkan Platformu
Summary
Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.
Abstract
Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.
Introduction
Şu anda bir kültür alanı ayrı ayrı tek hücre yerleştirilmesi genellikle sınırlayıcı seyreltme veya floresan-aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) kullanılarak elde edilir. sadece kolayca elde edilebilir Bir pipet ve doku kültür plakaları, gereğine göre bir çok laboratuarlar için, sınırlayıcı seyreltme, uygun bir yöntemdir. Bu durumda, bir hücre süspansiyonu seri uygun bir hücre yoğunluğuna kadar seyreltilir ve daha sonra bir el ile bir pipet kullanarak kültür kuyu içine yerleştirilir. Bu bölmeli tek hücreler daha sonra, 1 ve koloni oluşumu 2 tarama genetik heterojenliğinin olarak, hücre analizi için kullanılmıştır. Sınırlayıcı seyreltme yöntemi Poisson dağılımı doğa% 37 3 maksimum olasılık tek hücreli olayları kısıtlar çünkü Ancak, bu yöntem yardım için bir robot kolu kullanarak olmadan düşük verimlilik ve emek-yoğun, olduğunu. entegre robot kol ile FACS makineleri doğru Plac tarafından Poisson dağılımının sınırlama üstesinden gelebilirBir anda 4 de hiç bir kültürde tek hücreli ing. Ancak, yüksek mekanik kayma gerilmesi 5 (böylece, hücre canlılığını indirdi) ve makine alım ve işletme maliyetleri çok laboratuvarda kullanımını sınırlıdır.
Çok verimli bir mikro 6 içine tek hücreler yüklemek için yukarıdaki sınırlamaları aşmak için, mikro cihazlar geliştirilmiştir. Ancak, mikro-yüklü hücreler nedeniyle tek hücreli yükleme olasılığını maksimize etmek için tek bir hücre olduğu yakın microwell her boyutunu yapma ihtiyacı, çoğalmaya için yeterli alan vermeyin. Kültür deneyleri daha büyük mikro-birçok hücre bazlı uygulamalar (örneğin, klonojenik analiz 7), gerekli olduğu için (90 – 650 um çapında ya da yan uzunluğunda), aynı zamanda uzun bir hücre kültürleri için izin vermek için kullanılmıştır. Ancak, sınırlayıcı seyreltme yöntemi gibi, onlar da 10 arasında değişen, düşük tek hücre yükleme verimliliği sahip -.% 30 89
Daha önce, 10 cihazı poli-dimetilsiloksan (PDMS) ile yapıldı. Ayrı ayrı mikro tek hücrelerin izole edilmesi ve izole edilmiş hücrelerin klonojenik deneyde uygulanmasını göstermek için yüksek verimli mikroakışkan platformu geliştirilmiş ve mikro dizilerinin iki grup ihtiva eder adres büyük ölçüde olan boyutu kuyucuklarda tek bir hücreyi yüklenirken verimliliğini artırabilir farklı mikro boyutlarda olan hücrenin önemli ölçüde daha büyüktür. Özellikle, bu "çift kuyu" kavramı kültür alanının büyüklüğü esnek o basit farklı hücre tiplerini ve uygulamalarına uygun cihazın tasarımını ayarlamak için yapım, tek hücreli yakalama verimliliği etkilemeden ayarlanmasına imkan verir. Bu yüksek verimli bir yöntem, hücre heterojenite çalışmaları ve monoklonal hücre çizgisi oluşturulması için uzun vadeli bir hücre kültür deneyleri için yararlı olacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikro-tabanlı bir aygıt sistemleri 6,14 örneğin 6 yakalama geniş çaplı tek bir hücre tek kök hücre çoğalması 15 gibi tek hücre manipülasyonu ve analiz için kullanılmıştır. De boyut, sayı ve şekil olsa da, özel uygulamalar için ayarlanabilmektedir kuyunun boyutu artar olduğunda tek hücre izolasyon verimi, her zaman ele almaktadır. 9,15
Mikro boyutu hücre yayılması ve büyümesi için izin vermek için büyütülür ise …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the National Health Research Institutes (03-A1 BNMP11-014).
Materials
| AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
| Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
| Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
| Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
| SU-8 50 negative photoresist | MicroChem | Y131269 | |
| SU-8 100 negative photoresist | MicroChem | Y131273 | |
| Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
| Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
| Scanning laser profilometer | KEYENCE | VK-X 100 | |
| Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | TRIDECAFLUORO-1,1,2,2-TETRAHYDROOCTYL. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract., reacts violently with water. |
| Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | SPACE SAVER VACUUM DESICCATOR 190MM WHITE BASE |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15072 | with 0.75 mm inner-diameter |
| Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bersing Technology | ALB001.500 | |
| DMEM basal medium | Gibco | 12800-017 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Hyclone | SH30071.03HI | |
| Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
| Recombinant enzyme mixture | Innovative cell technology | AM-105 | Accumax |
| DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
| Plastic syringe (1 mL) | BD Biosciences | 309659 | |
| 23 gauge blunt needles | Ever Sharp Technology, Inc. | TD21 | |
| Poly-tetrafluoroethene (PTFE) tubing | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |
Riferimenti
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Vermeulen, L., et al. Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity. P Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).
- Shapiro, H. M. . Practical flow cytometry. , (2005).
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single adult stem cell. Nature. 456 (7223), 804-808 (2008).
- Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science. Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).
- Rettig, J. R., Folch, A. Large-scale single-cell trapping and imaging using microwell arrays. Anal. Chem. 77 (17), 5628-5634 (2005).
- Liu, J., et al. Soft fibrin gels promote selection and growth of tumorigenic cells. Nat Mater. 11 (8), 734-741 (2012).
- Charnley, M., Textor, M., Khademhosseini, A., Lutolf, M. P. Integration column: microwell arrays for mammalian cell culture. Integr. Biol. 1 (11-12), 11-12 (2009).
- Lindstrom, S., et al. High-density microwell chip for culture and analysis of stem cells. PloS one. 4 (9), e6997 (2009).
- Lin, C. H., et al. A microfluidic dual-well device for high-throughput single-cell capture and culture. Lab Chip. 15 (14), 2928-2938 (2015).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angew Chem Int Edit. 37 (5), 550-575 (1998).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).
- Lindstrom, S., Andersson-Svahn, H. Miniaturization of biological assays – Overview on microwell devices for single-cell analyses. Bba-Gen Subjects. 1810 (3), 308-316 (2011).
- Lecault, V., et al. High-throughput analysis of single hematopoietic stem cell proliferation in microfluidic cell culture arrays. Nat Methods. 8 (7), 581-593 (2011).
- Park, J. Y., et al. Single cell trapping in larger microwells capable of supporting cell spreading and proliferation. Microfluid Nanofluid. 8 (2), 263-268 (2010).
- Tirino, V., et al. Cancer stem cells in solid tumors: an overview and new approaches for their isolation and characterization. FASEB J. 27 (1), 13-24 (2013).
- Chen, P. C., Huang, Y. Y., Juang, J. L. MEMS microwell and microcolumn arrays: novel methods for high-throughput cell-based assays. Lab Chip. 11 (21), 3619-3625 (2011).
- Liang, P., et al. Drug Screening Using a Library of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Reveals Disease-Specific Patterns of Cardiotoxicity. Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).
