This protocol describes a rapid and broadly applicable method for unbiased RNA-sequencing of viral samples from human clinical isolates.
Här redogör vi en nästa generations RNA sekvense protokoll som möjliggör de novo aggregat och inom värd variant samtal av virala genom som samlats in från kliniska och biologiska källor. Metoden är opartisk och universell; den använder slumpmässiga primrar för cDNA-syntes och kräver ingen tidigare kunskap om virala sekvensen innehåll. Innan bibliotekskonstruktion, är selektiv RNas H-baserad uppslutning som används för att tömma oönskade RNA – inklusive poly (rA) bärare och ribosomalt RNA – från den virala RNA-prov. Selektiv utarmning förbättrar både uppgifternas kvalitet och antalet unika läser i virala RNA sekvense bibliotek. Dessutom är en transposas-baserad "tagmentation" steg som används i protokollet eftersom det minskar den totala biblioteks byggtiden. Protokollet har möjliggjort en snabb djup sekvensering av över 600 Lassa och Ebolavirus prov-inklusive samlingar från både blod och vävnad isolat-och är brett tillämpbar för andra mikrobiella genomik studier.
Nästa generations sekvensering av virus från kliniska källor kan informera överföring och epidemiologin av infektioner, liksom bidra till att stödja ny diagnostik, vaccin och terapeutiska utveckling. cDNA syntes med användning slump primers har gjort det möjligt att upptäcka och montering av genomen från divergerande, co-infekterande eller ens nya virus 1,2. I likhet med andra objektiva metoder, oönskade föroreningar upptar många sekvense läser och slagsekvense resultat negativt. Värd och poly (rA) bärar-RNA är föroreningar som förekommer i många befintliga virala provsamlingar.
Protokollet beskriver ett effektivt och kostnadseffektivt sätt djupa sekvense RNA virusgenom baserade på objektiva total RNA-punkter. Metoden utnyttjar en RNas H selektiv utarmning steg 3 för att ta bort oönskade värd ribosomala och bärar-RNA. Selektiv utarmning berikar för viral innehåll (Figur 1) och förbättrar den övergripande kvaliteten på sekvenseringsdata(Figur 2) från kliniska prover. Dessutom är tagmentation tillämpas protokollet som avsevärt minskar bibliotek byggtiden. Dessa metoder har använts för att snabbt generera stora datamängder av Ebola och Lassa virusgenom 2,4,5 och kan användas för att studera ett brett spektrum av RNA-virus. Slutligen är metoden inte begränsad till humana prover; nyttan av selektiv utarmning visades på vävnadsprover som samlats in från Lassa-infekterade gnagare och icke-mänskliga primater sjukdomsmodeller 5,6.
Figur 1. Total RNA innehåll återspeglar Anrikning av Lassa Virus Innehåll Använda Selektiv Depletion. Från övergripande innehåll (RNA ingång) och anrikning av unik Lassa-virus (LASV) läser (bibliotek innehåll) på rRNA utarmning från nio olika kliniska isolat. Denna siffra har ändrats från 6 <em>. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Högre kvalitet Sequencing Efter Carrier RNA Depletion. Median bas kvaliteter per sekvense cykel av poly (rA) kontaminerad bibliotek Lassa-virus (röd) och kontroll (ingen bärare observerats i bibliotek, svart) från QC rapport 13. Både läsa en och läsa två av parade slut läser slås samman i biblioteket BAM fil och kvalitetsresultat visas vid varje bas. Denna siffra har ändrats från 6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Den virala RNA-punkter protokoll detaljer konstruktion av bibliotek direkt från extraheradeRNA samlas in från kliniska och biologiska prover. För att garantera personlig säkerhet, bör alla virala serum, plasma och vävnadsprover inaktiveras i lämpliga buffertar före RNA-extraktion. I vissa inaktive och utvinning kit, är bärare poly (rA) RNA ingår; detta kommer att tas bort under den inledande RNas H selektiv utarmning steg. Baserat på fullständig återhämtning, är den förväntade koncentrationen av bärare RNA 100 ng / l. I protokollet, är 110 ng / l oligo dT-RNA (1.1x bärarkoncentration) används för utarmning. Om poly (rA) bärare inte förekommer i provet, bör då oligo (dT) inte tillsättas före utarmning.
Följande protokoll är avsedd för 24 reaktioner i PCR-plattformat (upp till 250 | il volym). En tidigare version av detta protokoll rapporterades i Matranga, et al. 6.
Den skisserade tillvägagångssättet gör robust, universell, snabb sekvensering och användes för sekvensering av Ebolavirus under 2014 utbrottet 2,4. Genom att koppla selektiv utarmning och cDNA-syntes med tagmentation bibliotek konstruktion, var den totala processtiden minskas med ~ 2 dagar från tidigare adapter ligeringsmetoder. På senare tid har detta protokoll som används av internationella samarbetspartners och andra med stor framgång 15,16 och kommer att användas till laboratorium i Västafrika för att stödja lokala genomik-baserade studier och diagnostik 17.
Protokollet som beskrivs här använder slumpmässiga primrar för att framställa cDNA för virala RNA-seq bibliotek. Till skillnad från tidigare virala RNA-seq tillvägagångssätt, det krävs ingen a priori kunskap om sekvensdata eller omständlig och tidskrävande primer design för ett specifikt virus eller clade. Metoden kan tillämpas på alla virala RNA-prov. Till exempel var det används för att generera virus innehåll från både Ebolaoch Lassa prover 6. Protokollet kan även användas för värd transcriptomic, metagenomic och patogen upptäckt sekvenseringsprojekt 1.
Ett kritiskt steg i protokollet är riktad RNas H digerering, en hög genomströmning, billig metod för att ta bort oönskad bärare och värd-RNA från virala prover. Den selektiva utarmning steget i protokollet använder många komponenter och kräver skicklighet och noggrannhet. bör tas extra tid och omsorg under den första installationen.
Som de flesta kliniska serum- och plasmaprover har ofta mycket lite nukleinsyramaterial, kontaminering och provförlust är vanliga. För att undvika dessa problem, bör särskild försiktighet iakttas vid användning av detta protokoll. För det första är RNA mycket mottagliga för nedbrytning; Därför bör alla områden vara rena och fria från nukleaser. För det andra, för att identifiera prover som är lämpliga för användning i detta protokoll, bör QRT-PCR-analyser för både värd-RNA och virus användas för kvantifiering 5,6 </sup>. När man jämför Inknappningstal med sekvense resultat från protokollet, sekvense framgång (dvs generering av tillräckliga data för full viral montering) korrelerade med prover som innehöll åtminstone 100 pg total RNA och 1000 kopior av virus. Tredje, exponering för miljökällor nukleinsyror bör undvikas. Det protokoll som beskrivs här är gjort i ett biosäkerhet skåp för säkerhetsföreskrifter och för att begränsa miljöföroreningar. Dessutom har vår grupp och andra märkt att kommersiella enzymer kan vara en annan källa till kontamine bakteriella nukleinsyror i låga insampel 6,18. Användning av en ren arbetsyta (t.ex. PCR huva, biosäkerhet skåp) och negativa kontroller (t.ex. vatten eller buffert) kommer att lindra och spåra föroreningar, respektive. För prover med <100 pg av total RNA, endast poly (rA) bärar-RNA, inte rRNA bör vara uttömda för att säkerställa hög kvalitet sekvense resultat samtidigt begränsa materialförlust. för mycketlåga ingångssampler, kan cDNA-amplifieringsmetoder vara lämpligare 19, även om poly (rA) företag bör avlägsnas före cDNA-syntes.
Utarmning av värd rRNA berikar för viral innehåll i sekvensbibliotek och är tillämplig på olika provsamlingar inklusive serum eller plasma, och flera olika typer av vävnader från gnagare och icke-mänskliga primater 5,6. I icke-mänskliga organismer, läser anpassa till 28S rRNA kvarstod efter utarmning, vilket tyder på 28S rRNA är mindre konserverad mellan människa och andra arter 6,20. Vid användning av denna metod med icke-mänskliga isolat, kan det vara nödvändigt att komplettera med DNA-oligos komplementära till de olika rRNA-sekvenser av den specifika värd 3,21.
Eftersom protokollet är opartisk, läser viral kan representera endast en liten del av den totala innehållsbibliotek. Även rRNA är den mest förekommande arten av värd-RNA och endast en liten andel av rRNA läser (0; 1%) återfinns efter selektiv utarmning, kommer alla andra värd RNA (t.ex. mRNA) kvar efter utarmning och kan stå för många sekvense läser från provet. Därför "oversampling" (dvs oversequencing) enskilda bibliotek krävs för att få tillräckligt med täckning för viral montering och variant samtal. För våra studier försöker vi sekvens ~ 20 miljoner läser per prov att ha tillräckligt djup för analys av viral genomisk och tillhörande varianter samt metagenomic innehåll 2,5. För metagenomic och patogena discovery studier är det viktigt att notera att kontaminerande värd-DNA avlägsnas genom DNas matsmältningen. Därför virus och andra patogener som innehåller DNA-genomet kan förloras under processen, men RNA mellan fortfarande kan sekvenseras.
The authors have nothing to disclose.
This work has been funded in part with Federal funds from the National Institutes of Health, Office of Director, Innovator (No.: DP2OD06514) (PCS) and from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, under Contracts (No:HHSN272200900018C, HHSN272200900049C and U19AI110818).
96-Well PCR Plates | VWR | 47743-953 | |
Strips of Eight Caps | VWR | 47745-512 | |
Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | 50 ml bottle |
TURBO DNase | Ambion | AM2238 | post RNA extraction step, 2 U/µL, buffer included |
PCR cycler | any PCR cyclers | ||
Agencourt RNAClean XP SPRI beads | Beckman Coulter Genomics | A63987 | beads for RNA cleanup |
Real Time qPCR system | any system | ||
DynaMag-96 Side Skirted Magnet | Invitrogen | 12027 | |
70% Ethanol | prepare fresh | ||
qRT-PCR primers | IDT DNA | see Table 2 | |
5M NaCl | Ambion | AM9760G | |
1M Tris-HCl pH 7.4 | Sigma | T2663-1L | |
1M Tris-HCl pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
1M MgCl2 | Ambion | AM9530G | |
Linear acrylamide | Ambion | AM9520 | |
DNA oligos covering entire rRNA region | IDT DNA | see Table 3, order lab-ready at 100 µM | |
Oligo (dT) | IDT DNA | 40 nt long, desalted | |
Hybridase Thermostable RNase H | Epicentre | H39100 | |
RNase-free DNase Kit | Qiagen | 79254 | post selective depletion step |
SUPERase-In RNase Inhibitor | Ambion | AM2694 | |
Random Primers | Invitrogen | 48190-011 | mostly hexamers |
10 mM dNTP mix | New England Biolabs | N0447L | |
SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080-093 | with first-strand buffer, DTT |
Air Incubator | any air incubator cyclers | ||
NEBNext Second Strand Synthesis (dNTP-free) Reaction Buffer | New England Biolabs | B6117S | 10x |
E. coli DNA Ligase | New England Biolabs | M0205L | 10 U/μl |
E. coli DNA Polymerase I | New England Biolabs | M0209L | 10 U/μl |
E. coli RNase H | New England Biolabs | M0297L | 2 U/μl |
0.5M EDTA | Ambion | AM9261 | |
Agencourt AMPure XP SPRI beads | Beckman Coulter Genomics | A63881 | beads for DNA cleanup |
Elution Buffer | Qiagen | 10 mM Tris HCl, pH 8.5 | |
Quant-iT dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
Qubit fluorometer | Invitrogen | Q32857 | |
Nextera XT DNA Sample Prep Kit | Illumina | FC-131-1096 | |
Nextera XT DNA Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | |
Tapestation 2200 | Agilent | G2965AA | |
High Sensitivity D1000 reagents | Agilent | 5067-5585 | |
High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | |
BioAnalyzer 2100 | Agilent | G2939AA | |
High Sensitivity DNA reagents | Agilent | 5067-4626 | |
Library Quantification Complete kit (Universal) | Kapa Biosystems | KK4824 | alternative to tapestation, bioanalyzer for library quantification |