Syntes av våglängds skiftande DNA hybridiseringsprober med hjälp fotostabila cyaninfärgämnen
Summary
Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.
Abstract
I detta protokoll visar vi en metod för syntes av 2'-alkyn modifierad deoxiribonukleinsyra (DNA) strängar genom automatiserad fastfas-syntes med användning av standard-fosforamiditkemi. Oligonukleotider är post-syntetiskt märkt genom två nya fotostabila cyaninfärgämnen med användning av koppar-katalyserade klick-kemi. Syntesen för både givare och acceptor-färgämne beskrivs och utförs i tre steg i följd. Med DNA som den omgivande arkitekturen, dessa två färgämnen genomgå en energiöverföring när de bringas i omedelbar närhet genom hybridisering. Därför är hybridisering av två enkelsträngade DNA-strängar visualiseras genom en förändring av fluorescensfärg. Denna färgändring kännetecknas av fluorescensspektroskopi, men kan också observeras direkt genom användning av en handhållen ultraviolett (UV) -lampa. Konceptet med en dubbel fluorescensfärg avläsning gör dessa oligonukleotidprober utmärkta verktyg för molekylär avbildning speciellt när den beskrivna photostable färgämnen används. Därigenom är fotoblekning av de avbildningssonder förhindras, och biologiska processer kan observeras i realtid för en längre tidsperiod.
Introduction
Molecular imaging utgör en grundläggande teknik för att förstå biologiska processer i levande celler. 1-3 Utvecklingen av fluorescerande nukleinsyra baserade prober för sådana kemiska-biologiska tillämpningar har blivit ett växande forskningsfält. Dessa fluorescerande prober måste uppfylla några krav för att bli lämpliga verktyg för cell imaging. För det första bör de tillämpade färgämnen uppvisar fluorescens med hög kvantutbyten, stora Stokes skift och, viktigast av allt, höga photostabilities att möjliggöra långsiktiga in vivo imaging. Och för det andra, bör de visar en tillförlitlig fluorescensavläsning. Konventionell kromofor släckare-system bygger på avläsning av en enda fluorescens färg genom enkla förändringar i fluorescensintensitet. 4 Detta tillvägagångssätt bär risken för falskt positiva eller falskt negativa resultat på grund av autofluorescens av intracellulära komponenter eller låga signal-brusförhållanden på grund av oönskad härdning av andra comkomponenter. 4
Vi rapporterade nyligen om begreppet "DNA trafikljus" som visar dubbla fluorescens färg avläsning genom att använda två olika kromoforer. 5-6 Konceptet bygger på energiöverföring (ET) från donator-färgämnet till acceptor-färgämne som ändrar fluorescens färg (se figur 1). Detta möjliggör en mer tillförlitlig avläsning och därmed ger ett kraftfullt verktyg för fluorescerande avbildningssonder. Märkning av oligonukleotider med fluorescerande färgämnen kan åstadkommas genom två olika tillvägagångssätt. Färgämnen kan införlivas under den kemiska DNA-syntes på en fast fas genom användning av motsvarande modifierade fosforamidit byggstenar. 7 Denna metod är begränsad till färgämnen som är stabila under standard fosforamidit och avlägsnande av skyddsgrupper förhållanden. Som ett alternativ, var eftersyntetiska modifieringsmetoder är etablerade i oligonukleotid kemi. Här visar vi syntesen av en av våra nya bildertabell energiöverförings par 8,9 och efter syntetisk märkning av DNA genom att använda kopparkatalyserade 1,3-cykloaddition mellan azider och alkyner (CuAAC). 10
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll visar hela förfarandet för att märka DNA post syntetiskt via CuAAC av azid-modifierade fluorescerande färgämnen. Detta inkluderar syntesen av färgämnen och alkynen modifierade DNA samt märkningsförfarandet.
Syntesen av färgämnena följande fyra steg. Alla produkter kan erhållas genom en ganska enkel utfällning på grund av deras positiva laddning och ingen tidsödande kolonnkromatografi behövs. Införandet av aziden funktionaliteter vid den centrala kopplingsste…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansiellt stöd från Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Wa 1386 / 17-1), forsknings Training Group GRK 2039 (finansierat av DFG) och kit är tacksamma.
Materials
| synthesis | |||
| 4-Picoline | Sigma Aldrich | 239615 | |
| 1,3-Diiodopropane | Sigma Aldrich | 238414 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | 10660131 | HPLC grade |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | 10456870 | technical grade |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | 71290 | p.a. grade |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | 10626642 | technical grade |
| Indole-3-carboxaldehyde; 98% | ABCR | AB112969 | |
| Potassium carbonate, 99+% | Acros | 424081000 | |
| dimethylcarbonate | Sigma Aldrich | 517127 | |
| N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry over Molecular Sieve | Acros | 348435000 | |
| Sodium sulfate | Bernd Kraft | 12623.46 | |
| Ethanol, 99.5% | Acros | 397690010 | |
| Piperidine, 99% | Acros | 147181000 | |
| Diethylether | Fisher Scientific | 10407830 | technical grade |
| 2-Phenylindole-3-carboxaldehyde; 97% | ABCR | AB125050 | |
| 4-Methylquinoline | ABCR | AB117222 | |
| DNA synthesis | |||
| Expedite 8909 Nucleic Acid Synthesizer | Applied Biosystems | - | |
| DMT-dA(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | A111081 | |
| DMT-dT Phosphoramidite | Sigma Aldrich | T111081 | |
| DMT-dG(dmf) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | G11508 | |
| DMT-dC(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | C11108 | |
| Amidite Diluent for DNA synthesis | Sigma Aldrich | L010010 | |
| Ultrapure Acetonitrile for DNA synthesis | Sigma Aldrich | L010400 | |
| Cap A | Sigma Aldrich | L840000 | |
| Cap B | Sigma Aldrich | L850000 | |
| CPG dT Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | T461010 | |
| CPG dA(bz) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | A461010 | |
| CPG dG(ib) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | G461010 | |
| CPG dC(bz) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | C461010 | |
| ammonia (aqueous solution) | Fluka Analytical | 318612 | |
| centrifugal devices nanosep 0.45 µm | Pall | ODGHPC34 | |
| 5-(Benzylthio)-1H-tetrazole (Activator) | Sigma Aldrich | 75666 | |
| 2'-O-propargyl deoxyuridinephosphoramidite | Chem Genes | ANP-7754 | |
| workup | |||
| vacuum concentrator | Christ | ||
| clicking procedure | |||
| Tetrakis(acetonitrile)copper(I) hexafluorophosphate | Sigma Aldrich | 346276 | |
| Sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| EDTA disodium salt | Sigma Aldrich | E5134 | |
| TBTA-ligand | - | - | synthesized according to a literature procedure [1] |
| HPLC | |||
| HPLC-system | Shimadzu | ||
| MALDI-Biflex-IV spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| LC-318 C18 column | Supelcosil via Sigma Aldrich | 58368 | |
| determination of concentration | |||
| ND 1000 Spectrophotometer | nanodrop | ||
| sample preparation and spectroscopy | |||
| Cary 100 Bio | Varian | ||
| Fluoromax-3 fluorimeter | Jobin-Yvon | ||
| [1] R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855. |
Riferimenti
- Kobayashi, H., Ogawa, M., Alford, R., Choyke, P. L., Urano, Y. New strategies for fluorescent probe design in medical diagnostic imaging. Chem Rev. 110 (5), 2620-2640 (2010).
- Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence Lifetime Measurements and Biological Imaging. Chem. Rev. 110 (5), 2641-2684 (2010).
- Lee, J. S., Vendrell, M., Chang, Y. T. Diversity-oriented optical imaging probe development. Curr. Opin. Chem. Biol. 15 (6), 760-767 (2011).
- Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat. Biotechnol. 16 (1), 49-53 (1998).
- Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. #34;DNA Traffic Lights": Concept of Wavelength-Shifting DNA Probes and Application in an Aptasensor. ChemBioChem. 13 (8), 1136-1138 (2012).
- Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. DNA and RNA "Traffic Lights": Synthetic Wavelength-Shifting Fluorescent Probes Based on Nucleic Acid Base Substitutes for Molecular Imaging. J. Org. Chem. 78 (15), 7373-7379 (2013).
- Berndl, S., Wagenknecht, H. A. Fluorescent Color Readout of DNA Hybridization with Thiazole Orange as an Artificial DNA Base. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (13), 2418-2421 (2009).
- Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. Synthesis of a Photostable Energy-Transfer Pair for "DNA Traffic Lights". Eur. J. Org. Chem. 34, 7547-7551 (2014).
- Walter, H. K., Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. Development of a Wavelength-Shifting Fluorescent Module for the Adenosine Aptamer Using Photostable Cyanine Dyes. ChemistryOpen. 4 (2), 92-96 (2015).
- Gierlich, J., Burley, G. A., Gramlicj, P. M. E., Hammond, D. M., Carell, T. Click chemistry as a reliable method for the high-density postsynthetic functionalization of alkyne-modified DNA. Org. Lett. 8 (17), 3639-3642 (2006).
- Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. Synthesis of deoxyoligonucleotides on a polymer support. J. Am. Chem. Soc. 103 (11), 3185-3191 (1981).
- Fasman, G. D. . Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Volume 1: Nucleic Acids. , 589 (1975).
- Puglisi, J. D., Tinoco, J. I. Absorbance melting curves of RNA. Meth. Enzymol. 180, 304-325 (1989).
- Johansson, M. K., Fidder, H., Dick, D., Cook, R. M. Intramolecular Dimers: A New Strategy to Fluorescence Quenching in Dual-Labeled Oligonucleotide Probes. J. Am. Chem. Soc. 124, 6950-6956 (2002).
- Barrois, S., Wörner, S., Wagenknecht, H. A. The Role of Duplex Stability for Wavelength-Shifting Fluorescent DNA Probes: Energy Transfer vs Excition Interactions in DNA "Traffic Lights", Photochem. Photobiol. Sci. 13, 1126-1129 (2014).
