HPLC-basert analyse for å overvåke ekstracellulær nukleotid / Nukleosid- Metabolisme i Human kronisk lymfatisk leukemi celler

Summary

The protocol described here represents an easy and reproducible method that employs reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) to measure purine metabolism on chronic lymphocytic leukemia (CLL) cells cultured under different conditions.

Abstract

Denne fremgangsmåten beskriver en følsom, spesifikk og pålitelig og reproduserbar revers fase høy-ytelse væskekromatografi (RP-HPLC) analyse utviklet og validert for kvantifisering av ekstracellulære purinnukleotider og nukleosider produsert av renset kronisk lymfatisk leukemi (CLL) celler under forskjellige dyrkningsbetingelser . Kromatografisk separasjon av adenosin 5'-monofosfat (AMP), adenosin (ADO) og inosin (INO) utføres ved romtemperatur på en silika-basert reversert-fase-kolonne som brukes for polare forbindelse oppbevaring. Fremgangsmåten inkluderer en binær mobil fase, som består av 7 mM ammoniumacetat og acetonitril med en strømningshastighet på 1,00 ml / min. Eluatene blir overvåket ved bruk av en fotodiode-array UV-detektor innstilt på 260 nm. En standard kalibreringskurve generert for å beregne ligningen for den analytiske kvantifisering av hver purinforbindelse. Systemet kontroll, datainnsamling og analyse blir så utført. Bruk av denne protokollen, AMP, INO og ADO eluere på 7, 11 og 11,9 min, henholdsvis, og den samlede gangtid for hver prøve er 20 min. Denne protokollen kan påføres på forskjellige celletyper og cellelinjer (både fjæring og adherente), ved bruk av dyrkningsmedier som matrise. Fordelene er enkle og raske prøvepreparering og kravet om en liten mengde av supernatant for analyse. Videre er bruken av et serumfritt medium gjør det mulig å hoppe over proteinet utfellingstrinnet med acetonitril som påvirker den endelige konsentrasjonen av purin-forbindelser. En av begrensningene ved fremgangsmåten er kravet til likevektskolonnen kjøres før hver enkelt prøve løp, noe som gjør den totale driftstid på eksperimentet lengre og forhindrer høy gjennomstrømning screeningsprogrammer.

Introduction

Adenosin (ADO) er en purinnukleosidanalog med en adenin molekyl festet til et ribose sukkermolekyl gruppen via en glykosidbinding. Når den er tilstede i det ekstracellulære miljøet, beskytter cellene mot overdreven skade ved virkningen av immunsystemet. Denne rollen har blitt fremhevet ved hjelp av ulike sykdomsmodeller, for eksempel kolitt ^1, diabetes ^2, astma ^3, sepsis ^4, og iskemisk skade ^fem. En av hovedfunksjonene ADO er inhibering av immunresponsen hos svulsten mikromiljøet, noe som bidrar til reduksjon av tumorImmunflukt ^6. Av denne grunn er de mekanismene som er involvert i dannelse og ADO signalering er av betydelig terapeutisk interesse ^7.

ADO nivåer i vev mikro er forholdsvis lav under normale fysiologiske betingelser og i hvert fall under sensitivitetsgrensen på immunceller. Men under hypoksi, ischemi, inflammasjon, infeksjon, metabolskstress og svulst forvandling de raskt øke ^åtte. De forhøyede ekstracellulære ADO nivåer i respons til vev-perturbing signaler har en dobbel funksjon: å rapportere vev skade i en autokrint og parakrint måte og å generere vev responser som kan generelt sett på som cytoprotective.

Ekstracellulær ADO kan dannes gjennom en rekke mekanismer, som inkluderer frigivelse av intracellulære kamre mediert av nukleosid-transportører ⁹ eller akkumulering på grunn av nedsatt nedbrytning drives av adenosindeaminase. Den viktigste vei som fører til økte ekstracellulære nivåer ADO omfatter virkningen av en kaskade av ectonucleotidases, som er membran-assosiert ectoenzymes genererer ADO ved phosphohydrolysis av nukleotider som frigjøres fra døde eller døende celler. Denne veien går gjennom den sekvensielle handling av CD39 (ectonucleoside trifosfat diphosphohydrolase-1) som konverterer ekstracellulære adenosin 5'-trifosfat (ATP) eller adenosin-5'-difosfat (ADP) til adenosin-5'-monofosfat (AMP) og CD73 (5'-nukleotidase), som konverterer AMP til ADO ^10.

Ekstracellulær ADO utløser sine fysiologiske responser ved å binde seg til fire transmembrane ADO-reseptorer, nemlig A1, A2A, A2B og A3. Hver reseptor har forskjellige affinitet for ADO og spesifikk fordeling vev. Alle reseptorene har syv transmembrandomener og er i G-proteinkoblet til intracellulære GTP-bindende proteiner (G-proteiner), som kan indusere (Gs-proteinet) eller inhiberer (Gi protein) adenylatsyklase-aktivitet og, senere, produksjonen av intracellulær cAMP. Derfor endringer i cytoplasma cAMP-nivåer innvirkning på intracellulært protein-kinase-aktivitet under fysiologiske responser ^11. Under fysiologiske betingelser ekstracellulære ADO er under 1 pm, som kan aktivere ukritisk A1, A2A og A3-reseptorer. Imidlertid aktivering av A2B subtype krever betydelig høyerekonsentrasjoner av nukleosidet, for eksempel de som er oppnådd under patofysiologiske betingelser. Alternativt kan ekstracellulære ADO bli degradert til inosin (INO) av adenosindeaminase (ADA) og CD26, en ADA kompleksprotein lokalisere ADA på celleoverflaten. En annen mulighet er at ADO er internalisert av cellen gjennom nukleosidlikevektstransportør transportører (ØNH) og fosforylert til AMP av ADO kinase protein ^12,13.

Formålet med denne protokollen er å beskrive en analytisk metode for revers fase høy-ytelse væskekromatografi (RP-HPLC) for å kvantifisere i en enkelt kjøring substratet AMP og produktene ADO og INO, som genereres av humane lymfocytter. Vår erfaring var i utgangspunktet oppnådd ved bruk av celler fra kronisk lymfatisk leukemi (KLL) pasienter, som er preget av utvidelsen av en moden befolkning på CD19 ⁺ / CD5 ⁺ B-lymfocytter konstitutivt uttrykker CD39 ^14,15. Vi viste ca 30%av KLL pasienter uttrykker CD73 ectoenzyme og at dette fenotype korrelerer med dårlig prognose ^16. Denne undergruppe av leukemiceller co-uttrykker CD39 og CD73 kan aktivt produsere ekstracellulære ADO fra ADP og / eller AMP. Preinkubasjon av CD73 ⁺ CLL celler med α, β-metylen-ADP (APCP), en kjent inhibitor av CD73 enzymatisk aktivitet, fullstendig blokkerer ekstracellulære ADO syntese bekreftet at CD73 representerer en flaskehals og enzym fra det kaskade ^16.

KLL celler også uttrykker ADA og ADA komplekse protein CD26, som er ansvarlig for konvertering av ADO i INO. Ved å bruke spesifikke ADA-inhibitorer, slik som erytro-9- (2-hydroksy-3-nonyl) I wiadenine (EHNA) -hydroklorid og deoksykoformycin (DCF), er det mulig å blokkere ekstracellulære ADO degraderingen INO. Videre forbehandling med en ADA-inhibitor i kombinasjon med dipyridamol, som blokkerer nukleosid transportører, forbedrer ADO akkumulering i cellensupernatanter.

Vi har deretter utvidet denne protokollen til celler som stammer fra andre linjer, inkludert T-lymfocytter og myeloide celler, bekrefter CD73-avhengig ADO produksjon. Disse funnene tyder på at denne HPLC-protokollen er meget allsidig, og at den kan brukes til forskjellige celle linjer og til forskjellige dyrkningsbetingelser (figur 1).

Figur 1. Skjematisk fremstilling av den enzymatiske maskineri ansvarlig for ekstracellulær ADO produksjon. Adenosin-5'-trifosfat (ATP) og / eller adenosin-5'-difosfat (ADP) kan brytes ned av CD39 til adenosin 5'-monofosfat (AMP), hvilken i sin tur omdannes av CD73 til nukleosidet adenosin (ADO). Når ADO er produsert i det ekstracellulære rom, kan det inn igjen i cellen gjennom nukleosid transportører (ENT), omdannes til inosin (INO) ellerbinde seg til forskjellige typer P1 ADO reseptorer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Protocol

KLL blodprøver er innhentet i henhold til institusjonelle retningslinjer og Helsinkideklarasjonen. 1. Isolering av leukemisk lymfocytter fra blodprøver av KLL Samle blodprøve i natrium heparin (grønn-top) tube 17. Lag 1: 3 fortynning av helt blod med RT 1 x fosfatbufret saltvann (PBS). Rens perifere mononukleære blodceller (PBMC) fra blodprøver ved tetthetsgradient sentrifugering. Underlag 5 ml av densitetssentrifugering media (for eksempel Ficoll…

Representative Results

For å vurdere den prosentvise (%) av leukemiske celler i ferskt renset PBMC fra et representativt CLL pasient, blir cellene merket med anti-CD19 og anti-CD5-antistoffer. Det venstre panel i figur 3 representerer et cytofluorimetric dot tomt med en selektiv port på levende celler. Figur 3 viser et eksempel på PBMC fra en pasient før CLL (midtre panel) og etter (høyre panel) B-celle rensing. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1"…

Discussion

Protokollen er beskrevet her gjør det mulig å evaluere aktiviteten av CD39 / CD73 adenosinergic maskineri i cellekulturmedier fra rensede humane leukemiceller. Gjennom denne HPLC metoden kan vi følge og kvantitativt måle enzymatisk generasjon av ADO (CD73-avhengig) og påfølgende degradering til INO (CD26 / ADA avhengig). Bruken av enzyminhibitorer gjør det mulig å kontrollere protokoll og for å ha intern kontroll. Fordelene og nyheter i denne protokollen er at i) den kan anvendes på celler som vokser i kultur,…

Materials

Human blood
Milli-Q water	Millipore		double deionised water
Ficoll-Paque Plus	GE-Healthcare	17-1440-03
purified anti-CD3, -CD14, -CD16	made in-house		mouse monoclonal
PE-labeled anti-CD19	Miltenyi Biotec	120-014-229
FITC-labeled anti-CD5	Miltenyi Biotec	130-096-574
Dynabeads sheep anti-mouse IgG	Invitrogen	11031
Phosphate-buffered saline (PBS)	Amresco	E404-200TABS	tablets
bovine serum albumin (BSA)	ID bio	1000-70	standard grade
isolation buffer			PBS 0.1 % BSA 2 mM EDTA, pH 7.4
AIM V serum free medium	GIBCO	12055-091	liquid (research grade)
adenosine 5’-diphosphate (ADP)	Sigma-Aldrich	A2754
adenosine 5’-monosphate (AMP)	Sigma-Aldrich	A1752
adenosine (ADO)	Sigma-Aldrich	A9251
inosine (INO)	Sigma-Aldrich	I4125
α,β-methylene-ADP (APCP)	Sigma-Aldrich	M8386	CD73 inhibitor
EHNA hydrochloride	Sigma-Aldrich	E114	adenosine deaminase inhibitor
Deoxycoformycin (dCF)	Tocris	2033	adenosine deaminase inhibitor
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Dipyridamole	Sigma-Aldrich	D9766	nucleoside transporter inhibitor
acetonitrile (CHROMASOLV Plus)	Sigma-Aldrich	34998	HPLC-grade
ammonium acetate	Sigma-Aldrich	9688	7 mM, pH 3.0
hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	30721-1L	min. 37 %
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Bürker cell counter	VWR	631-0920	hemocytometer
DynaMag-15 Magnet	Invitrogen	12301D	Dynal magnetic bead separator
microcentrifuge safe-lock tubes	Eppendorf	030-120-0086	1.5 ml
PET centrifuge tubes	Corning	430053/430304	15 – 50 ml
Minisart RC4 syringe filters	Sartorius Stedim Biotech	17821	membrane 0.2 µm
short thread vials	VWR	548-0029	1.5 ml/glass
micro-inserts	VWR	548-0006	0.1 ml/glass
screw caps	VWR	548-0085	9 mm/PP blue
Atlantis dC18 Column	Waters	186001344	5 µm, 4.6 x 150 mm
Atlantis dC18 Guard Column	Waters	186001323	5 µm, 4.6 x 20 mm
Waters Alliance 2965 Separations Module	Waters		HPLC separation module
Waters 2998 Photodiode Array (PDA) Detector	Waters		UV detector
Waters Empower2 software	Waters