Meting van overlevingstijd bij<em> Brachionus</em> Raderdiertjes: Synchronisatie van Maternal Voorwaarden

Summary

Rotifers are microscopic zooplankton used as models in ecotoxicological and aging studies. Here we provide a protocol for powerful and reproducible measurement of survival time in Brachionus rotifers. Synchronization of culture conditions over several generations is of particular importance because maternal condition affects life history of offspring.

Abstract

Rotifers are microscopic cosmopolitan zooplankton used as models in ecotoxicological and aging studies due to their several advantages such as short lifespan, ease of culture, and parthenogenesis that enables clonal culture. However, caution is required when measuring their survival time as it is affected by maternal age and maternal feeding conditions. Here we provide a protocol for powerful and reproducible measurement of the survival time in Brachionus rotifers following a careful synchronization of culture conditions over several generations. Empirically, poor synchronization results in early mortality and a gradual decrease in survival rate, thus resulting in weak statistical power. Indeed, under such conditions, calorie restriction (CR) failed to significantly extend the lifespan of B. plicatilis although CR-induced longevity has been demonstrated with well-synchronized rotifer samples in past and present studies. This protocol is probably useful for other invertebrate models, including the fruitfly Drosophila melanogaster and the nematode Caenorhabditis elegans, because maternal age effects have also been reported in these species.

Introduction

Raderdiertjes zijn microscopisch kleine kosmopolitische zoöplankton (<1 mm) die de stam Rotifera ¹ vormen. Ze hebben een eenvoudige bouwplan bestaat uit ongeveer 1000 somatische cellen en een karakteristieke wielvormige ciliaire inrichting genoemd corona, die wordt gebruikt voor vervoer en voeding. De meeste raderdiertjes behoren tot klassen monogononta of bdelloidea, die ongeveer 1.600 en 500 soorten, respectievelijk ² bevatten. Monogononta raderdiertjes hebben over het algemeen zowel geslachtelijke en ongeslachtelijke voortplanting fasen (cyclische parthenogenese), terwijl bdelloid raderdiertjes reproduceren door verplichte parthenogenese ^3. Het is dus mogelijk om genetisch identieke rotifeer individuen, die een hoge reproduceerbaarheid zorg draagt ​​voor experimenten te verkrijgen. Bovendien hebben ze een aantal andere voordelen modelorganismen, zoals een korte levensduur, gemakkelijk cultuur, beschikbaarheid van genomische en transcriptoom sequentiegegevens ^4-7, en een unieke fylogenetische positie op afstand van eenrthropods en nematoden ^8. Raderdiertjes zijn dus veelbelovend ongewervelde modellen in ecologische, toxicologische en veroudering studies ^9-12.

Het voortbestaan ​​tijd onder blootstelling aan omgevingsfactoren stress of chemicaliën is een vaak gemeten parameter in deze onderzoeksgebieden ^13-19. Toch is voorzichtigheid geboden bij het meten van de overlevingstijd van raderdiertjes, want het is gevoelig voor milieu-omstandigheden van hun moeders. Namelijk, in de monogononta raderdiertje Brachionus manjavacas, vrouwelijke nakomelingen van de leeftijd van de moeders hebben een kortere levensduur dan die van de jonge moeders; echter maternale calorie restrictie (CR) gedeeltelijk compenseert de nadelige effecten van maternale leeftijd ^20. In B. plicatilis, moeder CR biedt nakomelingen levensduur, lange overlevingstijd onder honger, en een hoge oxidatieve stress weerstand geassocieerd met een verhoogde expressie van antioxidant enzymen ^21,22. De leeftijd van de moeder effectis ook waargenomen in bdelloid raderdiertjes ^23. Daarom moeten de voorwaarden van experimentele raderdiertjes zorgvuldig gesynchroniseerd over verschillende generaties voor metingen van overlevingstijd.

Hier bieden we een protocol voor het meten van overlevingstijd bij Brachionus raderdiertjes na synchronisatie van kweekomstandigheden over meerdere generaties. Intermitterende vasten (IF), een variant van CR waarbij raderdiertjes periodiek worden toegevoerd, werd toegepast om het effect van synchronisatie onthullen door de bekende effecten van IF op levensduur ^22,24.

Protocol

1. Voorbereiding van de Media Opmerking: Gebruik half-verdund Brujewicz kunstmatig zeewater van het zoutgehalte 16,5 ppt (PSU). Andere kunstmatige zeewater wordt ook vaak gebruikt om de cultuur Brachionus raderdiertjes 25,26. Voeg 454 mM NaCl, 26 mM MgCl2, 27 mM MgSO4, 10 mM KCl en 10 mM CaCl 2-4,5 L gedestilleerd water (uiteindelijk volume 5 L zijn). U kunt ook gebruik maken van gedemineraliseerd water verdunnen in plaats van g…

Representative Results

Figuur 1 toont vertegenwoordiger survival curves van slecht gesynchroniseerde bevolking (van twee herhalingen). In dit experiment, raderdiertjes waren ofwel dagelijks gevoed [ad libitum (AL) groep] of om de dag (IF groep). De mediane overleving was 13 en 18 dagen in de AL en IF groepen, respectievelijk. Hoewel het bekend is dat IF verlengt de levensduur van de rotifer dit experiment niet een statistisch significant verschil tussen de levensduur van de AL e…

Discussion

Het huidige protocol beschrijft een werkwijze voor het meten van de overlevingstijd bij raderdiertjes Brachionus. De kritische stap is de synchronisatie van rotifer voorwaarden over meerdere generaties. Wanneer experimentele raderdiertjes goed worden gesynchroniseerd, is een typisch type I survival curve waargenomen met zeer weinig vroege mortaliteit zoals gerapporteerd in een aantal eerdere studies ^18,24,37,38. Standaarddeviatie van hun overlevingstijd dus kleiner geworden in vergelijking met slecht…

Materials

Sodium chloride	Wako	190-13921
Magnesium chloride	Wako	136-03995
Magnesium sulfate	Wako	131-00427
Potassium chloride	Wako	168-22111
Calcium chloride	Wako	035-00455
Sodium bicarbonate	Wako	199-05985
Sodium bromide	Wako	190-01515
Membrane filter (0.45 µm pore size)	Millipore	HAWP04700
Culture plate, 6-well, non-treated	Thomas Scientific	6902D01	Flat bottom
Culture plate, 48-well, non-treated	Thomas Scientific	6902D07	Flat bottom
Tetraselmis, Living	Carolina Biological Supply Company	152610
PRISM 6	GraphPad Software	Version 6.0d