Misurazione del Tempo di sopravvivenza in<em> Brachionus</em> Rotiferi: Sincronizzazione di materni Condizioni
Summary
Rotifers are microscopic zooplankton used as models in ecotoxicological and aging studies. Here we provide a protocol for powerful and reproducible measurement of survival time in Brachionus rotifers. Synchronization of culture conditions over several generations is of particular importance because maternal condition affects life history of offspring.
Abstract
Rotifers are microscopic cosmopolitan zooplankton used as models in ecotoxicological and aging studies due to their several advantages such as short lifespan, ease of culture, and parthenogenesis that enables clonal culture. However, caution is required when measuring their survival time as it is affected by maternal age and maternal feeding conditions. Here we provide a protocol for powerful and reproducible measurement of the survival time in Brachionus rotifers following a careful synchronization of culture conditions over several generations. Empirically, poor synchronization results in early mortality and a gradual decrease in survival rate, thus resulting in weak statistical power. Indeed, under such conditions, calorie restriction (CR) failed to significantly extend the lifespan of B. plicatilis although CR-induced longevity has been demonstrated with well-synchronized rotifer samples in past and present studies. This protocol is probably useful for other invertebrate models, including the fruitfly Drosophila melanogaster and the nematode Caenorhabditis elegans, because maternal age effects have also been reported in these species.
Introduction
Rotiferi sono microscopici cosmopolita zooplancton (<1 mm), che costituiscono il phylum Rotifera 1. Hanno un semplice piano corpo composto di circa 1.000 cellule somatiche, nonché un apparato ciliare ruota-come caratteristica denominata corona, che viene utilizzato per la locomozione e l'alimentazione. La maggior parte dei rotiferi appartengono a classi Monogononta o Bdelloidea, che contengono circa 1.600 e 500 specie, rispettivamente 2. Rotiferi Monogonont hanno generalmente entrambe le fasi riproduttivo sessuale e asessuale (partenogenesi ciclico), mentre rotiferi bdelloid si riproducono per partenogenesi obbligatoria 3. È così possibile ottenere individui rotifere geneticamente identici, che assicura un'elevata riproducibilità in esperimenti. Inoltre, essi hanno diversi altri vantaggi come organismi modello, come una vita breve, facilità di coltura, la disponibilità dei dati di sequenza genomica e trascrittomica 4-7, ed una posizione filogenetica unica distante da unarthropods e nematodi 8. Rotiferi sono quindi promettenti modelli di invertebrati in ecologico, tossicologico, e l'invecchiamento studi 9-12.
Il tempo di sopravvivenza in condizioni di esposizione a stress ambientale o sostanze chimiche è un parametro spesso misurato in questi campi di ricerca 13-19. Tuttavia, la cautela è necessaria quando si misura il tempo di sopravvivenza dei rotiferi, perché è suscettibile a condizioni ambientali delle loro madri. Vale a dire, nel monogonont Manjavacas rotifero Brachionus, prole femminile da madri di età hanno una durata più breve rispetto a quelli da giovani madri; tuttavia, la restrizione calorica materna (CR) compensa in parte gli effetti deleteri di avanzata età materna 20. In B. plicatilis, materna CR fornisce longevità prole, il tempo di sopravvivenza a lungo sotto la fame, ed elevata resistenza stress ossidativo associato con una maggiore espressione di enzimi antiossidanti 21,22. L'effetto dell'età maternaè stato osservato anche in rotiferi bdelloid 23. Pertanto, le condizioni di rotiferi sperimentali devono essere attentamente sincronizzate su più generazioni prima di misurazioni del tempo di sopravvivenza.
Qui forniamo un protocollo per la misurazione del tempo di sopravvivenza in rotiferi Brachionus dopo la sincronizzazione delle condizioni di coltura per diverse generazioni. Digiuno intermittente (IF), una variazione di CR dove rotiferi vengono alimentati periodicamente, è stato applicato per rivelare l'effetto della sincronizzazione a causa degli effetti ben noti di IF sulla longevità 22,24.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'attuale protocollo descrive un metodo per misurare il tempo di sopravvivenza in rotiferi Brachionus. Il passo fondamentale è la sincronizzazione delle condizioni di rotiferi per diverse generazioni. Quando rotiferi sperimentali sono ben sincronizzati, una curva di sopravvivenza che tipo tipico è osservata con molto poco mortalità precoce come riportato in diversi studi precedenti 18,24,37,38. Le deviazioni standard del loro tempo di sopravvivenza di conseguenza diventano più piccoli rispett…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati a George Jarvis, Martha Bock, e Bette Hecox-Lea, Marine Biological Laboratory, per il loro aiuto in riprese.
Materials
| Sodium chloride | Wako | 190-13921 | |
| Magnesium chloride | Wako | 136-03995 | |
| Magnesium sulfate | Wako | 131-00427 | |
| Potassium chloride | Wako | 168-22111 | |
| Calcium chloride | Wako | 035-00455 | |
| Sodium bicarbonate | Wako | 199-05985 | |
| Sodium bromide | Wako | 190-01515 | |
| Membrane filter (0.45 µm pore size) | Millipore | HAWP04700 | |
| Culture plate, 6-well, non-treated | Thomas Scientific | 6902D01 | Flat bottom |
| Culture plate, 48-well, non-treated | Thomas Scientific | 6902D07 | Flat bottom |
| Tetraselmis, Living | Carolina Biological Supply Company | 152610 | |
| PRISM 6 | GraphPad Software | Version 6.0d |
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