Måling av overlevelsestid i<em> Brachionus</em> Rotatorier: Synkronisering av mors betingelser

Summary

Rotifers are microscopic zooplankton used as models in ecotoxicological and aging studies. Here we provide a protocol for powerful and reproducible measurement of survival time in Brachionus rotifers. Synchronization of culture conditions over several generations is of particular importance because maternal condition affects life history of offspring.

Abstract

Rotifers are microscopic cosmopolitan zooplankton used as models in ecotoxicological and aging studies due to their several advantages such as short lifespan, ease of culture, and parthenogenesis that enables clonal culture. However, caution is required when measuring their survival time as it is affected by maternal age and maternal feeding conditions. Here we provide a protocol for powerful and reproducible measurement of the survival time in Brachionus rotifers following a careful synchronization of culture conditions over several generations. Empirically, poor synchronization results in early mortality and a gradual decrease in survival rate, thus resulting in weak statistical power. Indeed, under such conditions, calorie restriction (CR) failed to significantly extend the lifespan of B. plicatilis although CR-induced longevity has been demonstrated with well-synchronized rotifer samples in past and present studies. This protocol is probably useful for other invertebrate models, including the fruitfly Drosophila melanogaster and the nematode Caenorhabditis elegans, because maternal age effects have also been reported in these species.

Introduction

Rotatorier er mikroskopiske kosmopolitisk zooplankton (<1 mm) som utgjør phylum Rotifera ^en. De har en enkel plan legeme sammensatt av ca. 1000 somatiske celler, så vel som en karakteristisk hjullignende stråleapparat kalt korona, som brukes for bevegelse og mating. De fleste rotatorier tilhøre klasser Monogononta eller Bdelloidea, som inneholder ca 1600 og 500 arter, henholdsvis ^2. Monogonont rotatorier generelt har både seksuelle og aseksuelle reproduktive faser (syklisk parthenogenesis), mens bdelloid rotatorier reprodusere ved obligatorisk parthenogenesis ^tre. Det er således mulig å oppnå genetisk identiske rotatorier individer, noe som sikrer høy reproduserbarhet i eksperimenter. I tillegg har de en rekke andre fordeler som modellorganismer, som for eksempel et kort levetid, enkel kultur, tilgjengelighet av genomiske og transcriptomic sekvensdata ^4-7, og en unik fylogenetiske posisjon fjernt fra enrthropods og nematoder ^8. Rotatorier er derfor lovende virvelløse modeller i økologiske, toksikologiske og aldring studier ^9-12.

Overlevelsestiden etter eksponering for miljøstress eller kjemikalier er en ofte målt parameter i disse forskningsfelt ^13-19. Men en utvise forsiktighet når du måler overlevelsestiden av rotatorier fordi det er utsatt for miljøforhold av sine mødre. Nemlig i monogonont rotatorier Brachionus manjavacas, kvinnelig avkom fra alderen mødre har kortere levetid enn de fra unge mødre; Men mors kalori begrensning (CR) oppveier delvis de skadelige effektene av avansert mors alder ^20. I B. plicatilis, gir maternal CR avkom lang, lang overlevelsestid etter sult, og høy oksidativt stress motstand assosiert med økt uttrykk av antioksidant enzymer ^21,22. Den mors alder effekthar også blitt observert i bdelloid rotatorier ^23. Derfor bør betingelsene for eksperimentelle rotatorier være nøye synkroniseres over flere generasjoner før målinger av overlevelsestiden.

Her gir vi en protokoll for måling av overlevelsestid i Brachionus rotatorier etter synkronisering med dyrkningsforhold over flere generasjoner. Intermitterende faste (IF), en variasjon av CR hvor rotatorier tilføres med jevne mellomrom, ble påført for å vise effekten av synkroniseringen på grunn av de kjente virkninger av IF om levealder ^22,24.

Protocol

1. Utarbeidelse av Media Merk: Bruk halv utvannet Brujewicz kunstig sjøvann av saltholdighet 16,5 ppt (PSU). Andre kunstige havvann blir også ofte brukt til kultur Brachionus rotatorier 25,26. Legg 454 mM NaCl, 26 mM MgCl2, 27 mM MgSO4, 10 mM KCl og 10 mM CaCl 2 til 4,5 l destillert vann (sluttvolum vil være 5 L). Alternativt kan bruke deionisert fortynning vann i stedet for destillert vann. Legg CaCl 2 etter oppl?…

Representative Results

Figur 1 viser representative overlevelseskurver av dårlig synkronisert populasjoner (av to replikater). I dette eksperimentet, hjuldyr var enten matet hver dag [ad libitum (AL) gruppe] eller annenhver dag (IF gruppe). Median overlevelse var 13 og 18 dager i AL og hvis grupper, henholdsvis. Selv om det er velkjent at IF forlenger levetiden av rotatorier, dette eksperimentet ikke klarte å påvise en statistisk signifikant forskjell mellom lifespans av AL o…

Discussion

Den nåværende protokollen beskriver en fremgangsmåte for måling av overlevelsestiden i Brachionus rotatorier. Den kritiske trinnet er synkronisering av rotatorier forhold over flere generasjoner. Når eksperimentelle rotatorier er godt synkronisert, er en typisk type I overlevelseskurve observert med svært lite tidlig dødelighet som rapportert i flere tidligere studier ^18,24,37,38. Standardavvik av deres overlevelse derfor blitt mindre i forhold til dårlig synkroniserte rotatorier, noe som res…

Materials

Sodium chloride	Wako	190-13921
Magnesium chloride	Wako	136-03995
Magnesium sulfate	Wako	131-00427
Potassium chloride	Wako	168-22111
Calcium chloride	Wako	035-00455
Sodium bicarbonate	Wako	199-05985
Sodium bromide	Wako	190-01515
Membrane filter (0.45 µm pore size)	Millipore	HAWP04700
Culture plate, 6-well, non-treated	Thomas Scientific	6902D01	Flat bottom
Culture plate, 48-well, non-treated	Thomas Scientific	6902D07	Flat bottom
Tetraselmis, Living	Carolina Biological Supply Company	152610
PRISM 6	GraphPad Software	Version 6.0d