Determinación de la supervivencia en el tiempo<em> Brachionus</em> Los rotíferos: Sincronización de Condiciones maternas

Summary

Rotifers are microscopic zooplankton used as models in ecotoxicological and aging studies. Here we provide a protocol for powerful and reproducible measurement of survival time in Brachionus rotifers. Synchronization of culture conditions over several generations is of particular importance because maternal condition affects life history of offspring.

Abstract

Rotifers are microscopic cosmopolitan zooplankton used as models in ecotoxicological and aging studies due to their several advantages such as short lifespan, ease of culture, and parthenogenesis that enables clonal culture. However, caution is required when measuring their survival time as it is affected by maternal age and maternal feeding conditions. Here we provide a protocol for powerful and reproducible measurement of the survival time in Brachionus rotifers following a careful synchronization of culture conditions over several generations. Empirically, poor synchronization results in early mortality and a gradual decrease in survival rate, thus resulting in weak statistical power. Indeed, under such conditions, calorie restriction (CR) failed to significantly extend the lifespan of B. plicatilis although CR-induced longevity has been demonstrated with well-synchronized rotifer samples in past and present studies. This protocol is probably useful for other invertebrate models, including the fruitfly Drosophila melanogaster and the nematode Caenorhabditis elegans, because maternal age effects have also been reported in these species.

Introduction

Los rotíferos son microscópicos zooplancton cosmopolita (<1 mm) que constituyen el filo rotíferos ^1. Tienen un plan simple cuerpo compuesto de aproximadamente 1.000 células somáticas, así como un aparato ciliar rueda-como característica llamada la corona, que se utiliza para la locomoción y la alimentación. La mayoría de los rotíferos pertenecen a clases monogononta o Bdelloidea, que contienen alrededor de 1.600 y 500 especies, respectivamente ^2. Rotíferos monogononta generalmente tienen dos fases de reproducción sexual y asexual (partenogénesis cíclica), mientras que los rotíferos bdelloid reproducen por partenogénesis obligatoria ^3. Por tanto, es posible obtener individuos de rotíferos genéticamente idénticos, lo que garantiza una alta reproducibilidad en los experimentos. Además, tienen otras ventajas como organismos modelo, como una vida útil corta, la facilidad de la cultura, la disponibilidad de datos de la secuencia genómica y transcriptómica ^4-7, y una posición filogenética única distante de unarthropods ⁸ y nematodos. Por lo tanto, los rotíferos son prometedores modelos de invertebrados en ecológicos, toxicológicos y estudios de envejecimiento ^9-12.

El tiempo de supervivencia en virtud de la exposición al estrés ambiental o de productos químicos es un parámetro medido con frecuencia en estos campos de investigación ^13-19. Sin embargo, es necesario tener precaución cuando se mide el tiempo de supervivencia de los rotíferos porque es susceptible a las condiciones ambientales de sus madres. A saber, en el monogononta Manjavacas rotíferos Brachionus, la descendencia femenina de madres mayores tienen una vida más corta que las de las madres jóvenes; Sin embargo, la restricción calórica materna (CR) compensa parcialmente los efectos deletéreos de avanzada edad materna ^20. En B. plicatilis, CR materna proporciona la longevidad descendencia, el tiempo de supervivencia durante mucho tiempo bajo la inanición, y alta resistencia al estrés oxidativo asociado con una mayor expresión de enzimas antioxidantes ^21,22. El efecto de la edad maternaTambién se ha observado en los rotíferos bdelloid ^23. Por lo tanto, las condiciones de rotíferos experimentales deben ser sincronizados cuidadosamente durante varias generaciones antes de las mediciones de tiempo de supervivencia.

Aquí proporcionamos un protocolo para la medición del tiempo de supervivencia en rotíferos Brachionus siguiente sincronización de condiciones de cultivo durante varias generaciones. Ayuno intermitente (SI), una variación de CR, donde rotíferos se alimentan periódicamente, se aplicó a revelar el efecto de la sincronización debido a los efectos conocidos de SI sobre la longevidad ^22,24.

Protocol

1. Preparación de Medios Nota: Use la mitad diluida Brujewicz agua de mar artificial de la salinidad de 16,5 partes por mil (PSU). Otros aguas marinas artificiales también se utilizan con frecuencia para cultivo de rotíferos Brachionus 25,26. Añadir NaCl 454 mM, 26 mM MgCl 2, 27 mM MgSO4, se mM KCl 10, y 10 mM CaCl 2 a 4,5 L de agua destilada (volumen final será de 5 L). Como alternativa, utilizar agua de dilución desioniz…

Representative Results

La Figura 1 muestra las curvas de supervivencia de las poblaciones representativas mal sincronizados (de un total de dos repeticiones). En este experimento, los rotíferos fueron alimentados todos los días, ya sea [ad libitum grupo (AL)] o cada dos días (si el grupo). La mediana de supervivencia fue de 13 y 18 días en el AL y si los grupos, respectivamente. Aunque es bien conocido que si se extiende la vida útil de la rotíferos, este experimento no pu…

Discussion

El protocolo actual describe un método para medir el tiempo de supervivencia en rotíferos Brachionus. El paso crítico es la sincronización de las condiciones de rotíferos lo largo de varias generaciones. Cuando rotíferos experimentales están bien sincronizados, una curva de supervivencia de tipo I típico se observa con muy poca mortalidad temprana como se informó en varios estudios anteriores ^18,24,37,38. Las desviaciones estándar de su tiempo de supervivencia, por lo tanto se hacen más pe…

Materials

Sodium chloride	Wako	190-13921
Magnesium chloride	Wako	136-03995
Magnesium sulfate	Wako	131-00427
Potassium chloride	Wako	168-22111
Calcium chloride	Wako	035-00455
Sodium bicarbonate	Wako	199-05985
Sodium bromide	Wako	190-01515
Membrane filter (0.45 µm pore size)	Millipore	HAWP04700
Culture plate, 6-well, non-treated	Thomas Scientific	6902D01	Flat bottom
Culture plate, 48-well, non-treated	Thomas Scientific	6902D07	Flat bottom
Tetraselmis, Living	Carolina Biological Supply Company	152610
PRISM 6	GraphPad Software	Version 6.0d