JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Chimica

موقع إخراج صفها سبين والثوري دراسات طيفية القنوات Pentameric يجند بوابات ايون

Published: July 04, 2016
doi:
10.3791/54127
, ,
1Department of Physiology and Biophysics,Case Western Reserve University, 2School of Medicine,Case Western Reserve University

Summary

This article describes methods for site-directed spin labeling and reconstitution of pentameric ligand-gated channels for Electron Paramagnetic Resonance studies. This protocol can be adapted for any membrane protein. The reconstitution method described here can also be used for patch-clamp measurements of macroscopic and single-channel currents in a defined lipid system.

Abstract

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. Fundamental to these transitions is the intrinsic flexibility of the protein, which is critically modulated by membrane lipid-composition. To better understand the structural basis of channel function, it is necessary to study protein dynamics in a physiological membrane environment. Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy is an important tool to characterize conformational transitions between functional states. In comparison to NMR and X-ray crystallography, the information obtained from EPR is intrinsically of lower resolution. However, unlike in other techniques, in EPR there is no upper-limit to the molecular weight of the protein, the sample requirements are significantly lower, and more importantly the protein is not constrained by the crystal lattice forces. Therefore, EPR is uniquely suited for studying large protein complexes and proteins in reconstituted systems. In this article, we will discuss general protocols for site-directed spin labeling and membrane reconstitution using a prokaryotic proton-gated pentameric Ligand-Gated Ion Channel (pLGIC) from Gloeobacter violaceus (GLIC) as an example. A combination of steady-state Continuous Wave (CW) and Pulsed (Double Electron Electron Resonance-DEER) EPR approaches will be described that will enable a complete quantitative characterization of channel dynamics.

Introduction

على مدى العقد الماضي، نمت فهم الهيكلي من القنوات الأيونية بوابات يجند pentameric (pLGIC) في قدم وساق، وذلك بسبب تعدد الهياكل عالية الدقة من عدد من أعضاء الأسرة. العوامل الرئيسية التي أدت إلى التطورات الراهنة في مجال تشمل، اكتشاف قنوات pLGIC بدائية النواة، 1-3 تقدمات كبيرة في التعبير البروتين غشاء حقيقية النواة و4-6 واختراقات هائلة في النهج تحديد الهيكل. 7 وتوفر هذه الهياكل إجماع واضح على حفظ الشامل للبنية ثلاثية الأبعاد من pLGIC. ومع ذلك، مجالين رئيسيين التي يبدو أنها تتخلف وراء هي توصيف وظيفي لهذه الاستعدادات القناة ووصف الآلية وظيفة القناة.

النابضة التغييرات متعلق بتكوين معقدة وتحدث على مسافة 60 Å على طول القناة، والتضمين هذه التحولات على نطاق واسع من قبلنسبة الدهون في غشاء. على وجه الخصوص، وقد ثبت أن نسبة الدهون في السلبية، والكولسترول، والدهون الفوسفاتية لتعديل وظيفة pLGIC 8-11. في حين أن الدور الدقيق لهذه المكونات الدهنية في وظيفة القناة لا يزال غير معروف، فإن فهم الجزيئية كاملة من النابضة يتطلب دراسة هذه القنوات في بيئتهم المحلية. سبين موقع الموجه وصفها (SDSL) والكترون ممغطس الرنين (الثوري) الطيفي هي التقنيات من اختيار لدراسة ديناميات البروتين في النظم تشكيلها. الجيش الشعبي الثوري الطيفي لا يقتصر على حجم الجزيئية (كما هو NMR) أو الممتلكات البصرية من العينة (كما هو مضان الطيفي)، وبالتالي يسمح قياسات يبني كامل طول تشكيلها في الظروف الدهون الأم. تقنية حساسة للغاية ولها متطلبات عينة منخفضة نسبيا (في حدود بيكو الخلد). كل من هذه الجوانب تجعل هذه التقنية مناسبة تماما لدراسة بروتينات الغشاء الكبيرة التي يصعب التعبير في أكثر من مليغرامكميات.

وقد تم تطوير استخدام التحليل الطيفي EPR في تركيبة مع زيادة ونقصان وصفها موقع الموجه من قبل واين هوبيل والزملاء، وتم تكييفها لدراسة مجموعة واسعة من أنواع البروتين. وقد استخدمت 12-24 البيانات الثوري للتحقيق في الهياكل الثانوية، والتغيرات في البروتين التشكل، أعماق غشاء الإدراج، والبروتين البروتين / تفاعلات البروتين يجند.

الأسلوب ينطوي على استبدال السيستين في مواقف الفائدة بمقدار الطفرات موقع الموجه. لضمان وضع العلامات الخاصة بالموقع، فمن الضروري أن تكون بديلا cysteines الأصلي مع حامض أميني آخر (على سبيل المثال، سيرين) لإنشاء قالب السيستين أقل. حتى الآن، وتسمية تدور الأكثر شعبية هي MTSL-ثيول محددة: (1-oxyl-2،2،5،5-ميثيل-Δ3-بيرولين-3-الميثيل) methanethiosulfonate التي يعلقها على البروتين من خلال جسر ثاني كبريتيد السندات. نظرا لخصوصيته العالية، وصغر حجمها نسبيا (أكبر قليلا من التربتوفان)، والمرنبيليتي من المنطقة رابط، وقد تبين هذه التسمية تدور لديهم القابلية للتفاعل ممتاز حتى مع وجود السيستين دفن. وعلاوة على ذلك، لتحقيق أقصى قدر من التفاعل، ويتم وضع العلامات رد فعل من البروتين في شكل المنظفات بالفاعلات. بعد انفصال الزائدة حرة تدور التسمية من قبل اللوني حجم الإقصاء، وإعادة تشكيل البروتين في جسيمات شحمية أو أنظمة محاكاة طبقة ثنائية من تكوين الدهون محددة. بشكل عام، والسيستين الطفرات جيد التحمل في معظم أجزاء من البروتين، وحجم صغير نسبيا من زيادة ونقصان مسبار يسبب الحد الأدنى من اضطراب للهياكل الثانوية والثالثية. للتأكد من أن تعديل الاحتفاظ ظائف نوع البرية، وقنوات وصفت وأعيد يمكن دراستها عن طريق القياسات التصحيح، المشبك.

ثم يتعرض البروتين المسمى وظيفية لقياسات الطيفية، والتي توفر أساسا ثلاثة أنواع رئيسية من المعلومات: 12،14،15،20،22،23،25-27 ديناميات تدور التحقيق من قبل lineshتحليل القرد. إمكانية الوصول إلى التحقيق لعوامل الاسترخاء ممغطس. يتم قياس المسافة وتوزيع 27 مسافات الثوري التي كتبها نهجين مختلفين. ويستند أولا على تقنية موجة مستمرة (CW)، حيث الطيفية توسيع الناجمة عن التفاعلات ثنائي القطب بين تدور العلامات (في 8-20 مجموعة بعد). ويستخدم لتحديد مسافة 28،29 والثاني هو نابض-EPR طريقة حيث قياسات المسافة التي يمكن أن تمتد ما يصل الى 70 Å. 30-34 وفي نقرا الكترون الكترون الرنين (غزلان)، ويتم تحليل التذبذبات في السعة تدور الصدى لتحديد المسافات والتوزيعات بعد. هنا هو منظم صدى تدور في وتيرة التفاعل ثنائي القطب. معا، وتستخدم هذه المعايير لتحديد طوبولوجيا البروتين والعناصر الهيكلية الثانوية، والتغيرات البروتين بتكوين.

Protocol

1. الموقع الموجه الطفرات والسيستئين الطفرات الاستنساخ والطفرات ملاحظة: GLIC النوع البري (وزن) 35 له السيستين وحيد الأم (C27)، والذي تحور لسيرين لإنشاء خلفية السيستين أقل. وأدخلت الطفرات السيستين على خلفية ال?…

Representative Results

توصيف الكيمياء الحيوية من المسوخ GLIC المسمى سبين بعد بروتوكول صفها أعلاه سوف تسفر عادة GLIC-م ب ب البروتين الانصهار في حدود 10-12 ملغ / لتر من الثقافة. على الرغم من أن قد تختلف هذه القيمة عبر …

Discussion

وقد ثبت الطيفي EPR أن يكون النهج الهيكلي لا مثيل لها في قياس التغيرات متعلق بتكوين بروتينات الغشاء في البيئة القريبة من مسقط رأسه. هذا الأسلوب يتيح لنا نظرة خاطفة في التفاصيل الجزيئية ديناميات البروتين الذي يتم حجب في هياكل عالية الدقة من البلورات بالأشعة السينية وال?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونحن ممتنون جدا لأعضاء الحاليين والسابقين في المختبر Chakrapani للقراءة وتعليقات نقدية على المخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منحة (1R01GM108921) وجمعية القلب الأميركية (NCRP التنمية العلماء غرانت 12SDG12070069) وSC.

Materials

Site-Directed Mutagenesis and Cys mutations
10x PfuUltra HF reaction buffer Agilent Technologies 600380-52
dNTPS New England BioLabs Inc‎ N0447L 10mM each dNTP
pfu Ultra DNA polymerase Agilent Technologies 600380-51 2.5 U/ul
DPNI New England BioLabs Inc‎ R0176S 20,000 U/ml
XL10 GOLD Agilent Technologies 200314
SOC media New England BioLabs Inc‎ B9020S
Kanamycin Fisher Scientfic BP905
LB media Invitrogen 127957084
Miniprep kit QIAGEN 27106
C43 competent cells Lucigen 60446
Expression and Purification
Glucose Fisher Scientfic D16
Tryptone Fisher Bioreagents BP1421-500
Yeast extract Amresco J850
Glycerol Fisher Bioreagents BP229
K2HPO4 Amresco 0705
KH2PO4 Amresco 0781
IPTG (isopropyl-thio-β-galactoside) Gold Biotechnology I2481C25
Trizma Base Sigma Life Science T1503
NaCl Sigma-Aldrich S7653
DNase I Sigma Life Science DN25
PMSF Amresco M145
Leupeptine Amresco J580
Pepstatin Amresco J583
DDM (n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside) Anatrace D310S
Amylose resin New England BioLabs Inc‎ E8021L
TCEP Amresco K831
EDTA Fisher Scientfic BP118
Maltose Acros Organics 329915000
Superdex 200GL GE Healthcare 17-5175-01
Empty polypropylene Chromatography column BioRad 731-1550
Site-Directed Spin Labeling
MTSL (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-3-pyrroline-3-methyl) Methanethiosulfonate Toronto Reaserch chemicals Inc O873900
(1-acetoxy-2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrroline-3-methyl) methanethiosulfonate Toronto Reaserch chemicals Inc A167900
DMSO J.T. Baker 9224-01
Reconstitution
Asolectin lipid Avanti polar lipids Inc 541602C
Biobeads (Polystyrine beads) Bio Rad 152-3920
Methanol Fisher chemicals A413
FRET
Fluorescein-maleimide ThermoFisher Scientific F-150
Tetramethylrhodamine-maleimide ThermoFisher Scientific T-6027
POPC Avanti polar lipids Inc 850457C
POPG Avanti polar lipids Inc 840457C
E.Coli polar lipid extract Avanti polar lipids Inc 100600C
HEPES Sigma Life Science H3375
EPR measurement
TPX plastic capillaries Bruker ER221
EDDA (Ethylenediamine-N, N'-diacetic acid) Aldrich 158186
Ni(OH)2 Aldrich 283622
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Tasneem, A., Iyer, L. M., Jakobsson, E., Aravind, L. Identification of the prokaryotic ligand-gated ion channels and their implications for the mechanisms and origins of animal Cys-loop ion channels. Genome Biol. 6, 4 (2005).
  2. Hilf, R. J., Dutzler, R. X-ray structure of a prokaryotic pentameric ligand-gated ion channel. Nature. 452 (7185), 375-379 (2008).
  3. Bocquet, N., et al. X-ray structure of a pentameric ligand-gated ion channel in an apparently open conformation. Nature. 457 (7225), 111-114 (2009).
  4. Hibbs, R. E., Gouaux, E. Principles of activation and permeation in an anion-selective Cys-loop receptor. Nature. 474 (7349), 54-60 (2011).
  5. Miller, P. S., Aricescu, A. R. Crystal structure of a human GABAA receptor. Nature. 512 (7514), 270-275 (2014).
  6. Hassaine, G., et al. X-ray structure of the mouse serotonin 5-HT3 receptor. Nature. 512 (7514), 276-281 (2014).
  7. Du, J., Lu, W., Wu, S., Cheng, Y., Gouaux, E. Glycine receptor mechanism elucidated by electron cryo-microscopy. Nature. , (2015).
  8. Sunshine, C., McNamee, M. G. Lipid modulation of nicotinic acetylcholine receptor function: the role of neutral and negatively charged lipids. Biochim Biophys Acta. 1108, 240-246 (1992).
  9. Fong, T. M., McNamee, M. G. Correlation between acetylcholine receptor function and structural properties of membranes. Biochimica. 25 (4), 830-840 (1986).
  10. daCosta, C. J., Baenziger, J. E. A lipid-dependent uncoupled conformation of the acetylcholine receptor. J Biol Chem. 284 (26), 17819-17825 (2009).
  11. Criado, M., Eibl, H., Barrantes, F. J. Functional properties of the acetylcholine receptor incorporated in model lipid membranes. Differential effects of chain length and head group of phospholipids on receptor affinity states and receptor-mediated ion translocation. J Biol Chem. 259 (14), 9188-9198 (1984).
  12. Hubbell, W. L., Lopez, C. J., Altenbach, C., Yang, Z. Technological advances in site-directed spin labeling of proteins. Curr Opin Struct Biol. 23 (5), 725-733 (2013).
  13. Columbus, L., Hubbell, W. L. A new spin on protein dynamics. Trends Biochem Sci. 27 (6), 288-295 (2002).
  14. Hubbell, W. L., Cafiso, D. S., Altenbach, C. Identifying conformational changes with site-directed spin labeling. Nat Struct Biol. 7 (9), 735-739 (2000).
  15. McHaourab, H. S., Steed, P. R., Kazmier, K. Toward the fourth dimension of membrane protein structure: insight into dynamics from spin-labeling EPR spectroscopy. Structure. 19 (11), 1549-1561 (2011).
  16. Bordignon, E. Site-directed spin labeling of membrane proteins. Top Curr Chem. 321, 121-157 (2012).
  17. Klare, J. P., Steinhoff, H. J. Spin labeling EPR. Photosynth Res. 102 (2-3), 377-390 (2009).
  18. Drescher, M. EPR in protein science : intrinsically disordered proteins. Top Curr Chem. 321, 91-119 (2012).
  19. Perozo, E., Cuello, L. G., Cortes, D. M., Liu, Y. S., Sompornpisut, P. EPR approaches to ion channel structure and function. Novartis Found Symp. 245, 146-158 (2002).
  20. Fanucci, G. E., Cafiso, D. S. Recent advances and applications of site-directed spin labeling. Curr Opin Struct Biol. 16 (5), 644-653 (2006).
  21. Sahu, I. D., McCarrick, R. M., Lorigan, G. A. Use of electron paramagnetic resonance to solve biochemical problems. Biochimica. 52 (35), 5967-5984 (2013).
  22. Hubbell, W. L., McHaourab, H. S., Altenbach, C., Lietzow, M. A. Watching proteins move using site-directed spin labeling. Structure. 4 (7), 779-783 (1996).
  23. Altenbach, C., Marti, T., Khorana, H. G., Hubbell, W. L. Transmembrane protein structure: spin labeling of bacteriorhodopsin mutants. Science. 248 (4959), 1088-1092 (1990).
  24. McHaourab, H. S., Lietzow, M. A., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme. Correlation with protein structure and dynamics. Biochimica. 35 (24), 7692-7704 (1996).
  25. Farahbakhsh, Z. T., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Spin labeled cysteines as sensors for protein-lipid interaction and conformation in rhodopsin. Photochem Photobiol. 56 (6), 1019-1033 (1992).
  26. Altenbach, C., Greenhalgh, D. A., Khorana, H. G., Hubbell, W. L. A collision gradient method to determine the immersion depth of nitroxides in lipid bilayers: application to spin-labeled mutants of bacteriorhodopsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (5), 1667-1671 (1994).
  27. Altenbach, C., Froncisz, W., Hemker, R., McHaourab, H., Hubbell, W. L. Accessibility of nitroxide side chains: absolute Heisenberg exchange rates from power saturation EPR. Biophys J. 89 (3), 2103-2112 (2005).
  28. Rabenstein, M. D., Shin, Y. K. Determination of the distance between two spin labels attached to a macromolecule. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (18), 8239-8243 (1995).
  29. Altenbach, C., Oh, K. J., Trabanino, R. J., Hideg, K., Hubbell, W. L. Estimation of inter-residue distances in spin labeled proteins at physiological temperatures: experimental strategies and practical limitations. Biochimica. 40 (51), 15471-15482 (2001).
  30. Borbat, P. P., McHaourab, H. S., Freed, J. H. Protein structure determination using long-distance constraints from double-quantum coherence ESR: study of T4 lysozyme. J Am Chem Soc. 124 (19), 5304-5314 (2002).
  31. Chiang, Y. W., Borbat, P. P., Freed, J. H. The determination of pair distance distributions by pulsed ESR using Tikhonov regularization. J Magn Reson. 172 (2), 279-295 (2005).
  32. Jeschke, G. DEER distance measurements on proteins. Annu Rev Phys Chem. 63, 419-446 (2012).
  33. Jeschke, G., Polyhach, Y. Distance measurements on spin-labelled biomacromolecules by pulsed electron paramagnetic resonance. Phys Chem Chem Phys. 9 (16), 1895-1910 (2007).
  34. Jeschke, G., Wegener, C., Nietschke, M., Jung, H., Steinhoff, H. J. Interresidual distance determination by four-pulse double electron-electron resonance in an integral membrane protein: the Na+/proline transporter PutP of Escherichia coli. Biophys J. 86 (4), 2551-2557 (2004).
  35. Hilf, R. J., Dutzler, R. Structure of a potentially open state of a proton-activated pentameric ligand-gated ion channel. Nature. 457 (7225), 115-118 (2009).
  36. Velisetty, P., Chalamalasetti, S. V., Chakrapani, S. Conformational transitions underlying pore opening and desensitization in membrane-embedded Gloeobacter violaceus ligand-gated ion channel (GLIC). J Biol Chem. 287 (44), 36864-36872 (2012).
  37. Birnboim, H. C., Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).
  38. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  39. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
  40. McHaourab, H. S., Kalai, T., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme: effect of side chain structure. Biochimica. 38 (10), 2947-2955 (1999).
  41. Gross, A., Columbus, L., Hideg, K., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Structure of the KcsA potassium channel from Streptomyces lividans: a site-directed spin labeling study of the second transmembrane segment. Biochimica. 38 (32), 10324-10335 (1999).
  42. Velisetty, P., Chakrapani, S. Desensitization mechanism in a Prokaryotic ligand-gated ion channel. J Biol Chem. 287 (22), (2012).
  43. Velisetty, P., Chakrapani, S. Desensitization mechanism in prokaryotic ligand-gated ion channel. J Biol Chem. 287 (22), 18467-18477 (2012).
  44. Chakrapani, S., Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Structural dynamics of an isolated voltage-sensor domain in a lipid bilayer. Structure. 16 (3), 398-409 (2008).
  45. Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Structural dynamics of the KvAP pore domain lacking the voltage sensing domain. Biophysical Journal. 88 (1), 19-20 (2005).
  46. Perozo, E., Cortes, D. M., Cuello, L. G. Structural rearrangements underlying K+-channel activation gating. Science. 285 (5424), 73-78 (1999).
  47. Chakrapani, S., Sompornpisut, P., Intharathep, P., Roux, B., Perozo, E. The activated state of a sodium channel voltage sensor in a membrane environment. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (12), 5435-5440 (2010).
  48. Vasquez, V., Sotomayor, M., Cordero-Morales, J., Schulten, K., Perozo, E. A structural mechanism for MscS gating in lipid bilayers. Science. 321 (5893), 1210-1214 (2008).
  49. Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels. Nature. 418 (6901), 942-948 (2002).
  50. Kim, M., Xu, Q., Murray, D., Cafiso, D. S. Solutes alter the conformation of the ligand binding loops in outer membrane transporters. Biochimica. 47 (2), 670-679 (2008).
  51. Kazmier, K., Sharma, S., Islam, S. M., Roux, B., McHaourab, H. S. Conformational cycle and ion-coupling mechanism of the Na+/hydantoin transporter Mhp1. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), 14752-14757 (2014).
  52. Durr, K. L., et al. Structure and dynamics of AMPA receptor GluA2 in resting, pre-open, and desensitized states. Cell. 158 (4), 778-792 (2014).
  53. Borbat, P. P., et al. Conformational motion of the ABC transporter MsbA induced by ATP hydrolysis. PLoS Biol. 5 (10), e271 (2007).
  54. Zou, P., McHaourab, H. S. Increased sensitivity and extended range of distance measurements in spin-labeled membrane proteins: Q-band double electron-electron resonance and nanoscale bilayers. Biophys J. 98 (6), 18-20 (2010).
  55. Pannier, M., Veit, S., Godt, A., Jeschke, G., Spiess, H. W. Dead-time free measurement of dipole-dipole interactions between electron spins. J Magn Reson. 142 (2), 331-340 (2000).
  56. Jeschke, G., et al. DeerAnalysis2006-a comprehensive software package for analyzing pulsed ELDOR data. Applied Magnetic Resonance. 30 (3-4), 473-498 (2006).
  57. Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422 (6928), 180-185 (2003).
  58. Velisetty, P., Chalamalasetti, S. V., Chakrapani, S. Structural basis for allosteric coupling at the membrane-protein interface in Gloeobacter violaceus ligand-gated ion channel (GLIC). J Biol Chem. 289 (5), 3013-3025 (2014).
  59. Dellisanti, C. D., et al. Site-directed spin labeling reveals pentameric ligand-gated ion channel gating motions. PLoS Biol. 11 (11), e1001714 (2013).
  60. Labriola, J. M., et al. Structural sensitivity of a prokaryotic pentameric ligand-gated ion channel to its membrane environment. J Biol Chem. 288 (16), 11294-11303 (2013).
  61. Kinde, M. N., et al. Conformational Changes Underlying Desensitization of the Pentameric Ligand-Gated Ion Channel ELIC. Structure. 23 (6), 995-1004 (2015).
  62. Vasquez, V., Cortes, D. M., Furukawa, H., Perozo, E. An optimized purification and reconstitution method for the MscS channel: strategies for spectroscopical analysis. Biochimica. 46 (23), 6766-6773 (2007).
  63. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane protein assembly into Nanodiscs. FEBS Lett. 584 (9), 1721-1727 (2010).
  64. Hanson, S. M., Francis, D. J., Vishnivetskiy, S. A., Klug, C. S., Gurevich, V. V. Visual arrestin binding to microtubules involves a distinct conformational change. J Biol Chem. 281 (14), 9765-9772 (2006).
  65. McCoy, J., Hubbell, W. L. High-pressure EPR reveals conformational equilibria and volumetric properties of spin-labeled proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (4), 1331-1336 (2011).
  66. Mobius, K., et al. Combining high-field EPR with site-directed spin labeling reveals unique information on proteins in action. Magn Reson Chem. 43, 4-19 (2005).
  67. Lopez, C. J., Oga, S., Hubbell, W. L. Mapping Molecular Flexibility of Proteins with Site-Directed Spin Labeling: A Case Study of Myoglobin. Biochimica. 51 (33), 6568-6583 (2012).
  68. Fleissner, M. R., et al. Site-directed spin labeling of a genetically encoded unnatural amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (51), 21637-21642 (2009).
  69. Lorenzi, M., et al. Tyrosine-targeted spin labeling and EPR spectroscopy: an alternative strategy for studying structural transitions in proteins. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (39), 9108-9111 (2011).

Tags

Site Directed Spin LabelingEPR SpectroscopyPentameric Ligand-gated Ion ChannelsMembrane Protein DynamicsGLICSite-directed MutagenesisProtein PurificationCell LysisMembrane Protein Reconstitution

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Basak, S., Chatterjee, S., Chakrapani, S. Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels. J. Vis. Exp. (113), e54127, doi:10.3791/54127 (2016).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image