This article describes methods for site-directed spin labeling and reconstitution of pentameric ligand-gated channels for Electron Paramagnetic Resonance studies. This protocol can be adapted for any membrane protein. The reconstitution method described here can also be used for patch-clamp measurements of macroscopic and single-channel currents in a defined lipid system.
Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. Fundamental to these transitions is the intrinsic flexibility of the protein, which is critically modulated by membrane lipid-composition. To better understand the structural basis of channel function, it is necessary to study protein dynamics in a physiological membrane environment. Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy is an important tool to characterize conformational transitions between functional states. In comparison to NMR and X-ray crystallography, the information obtained from EPR is intrinsically of lower resolution. However, unlike in other techniques, in EPR there is no upper-limit to the molecular weight of the protein, the sample requirements are significantly lower, and more importantly the protein is not constrained by the crystal lattice forces. Therefore, EPR is uniquely suited for studying large protein complexes and proteins in reconstituted systems. In this article, we will discuss general protocols for site-directed spin labeling and membrane reconstitution using a prokaryotic proton-gated pentameric Ligand-Gated Ion Channel (pLGIC) from Gloeobacter violaceus (GLIC) as an example. A combination of steady-state Continuous Wave (CW) and Pulsed (Double Electron Electron Resonance-DEER) EPR approaches will be described that will enable a complete quantitative characterization of channel dynamics.
على مدى العقد الماضي، نمت فهم الهيكلي من القنوات الأيونية بوابات يجند pentameric (pLGIC) في قدم وساق، وذلك بسبب تعدد الهياكل عالية الدقة من عدد من أعضاء الأسرة. العوامل الرئيسية التي أدت إلى التطورات الراهنة في مجال تشمل، اكتشاف قنوات pLGIC بدائية النواة، 1-3 تقدمات كبيرة في التعبير البروتين غشاء حقيقية النواة و4-6 واختراقات هائلة في النهج تحديد الهيكل. 7 وتوفر هذه الهياكل إجماع واضح على حفظ الشامل للبنية ثلاثية الأبعاد من pLGIC. ومع ذلك، مجالين رئيسيين التي يبدو أنها تتخلف وراء هي توصيف وظيفي لهذه الاستعدادات القناة ووصف الآلية وظيفة القناة.
النابضة التغييرات متعلق بتكوين معقدة وتحدث على مسافة 60 Å على طول القناة، والتضمين هذه التحولات على نطاق واسع من قبلنسبة الدهون في غشاء. على وجه الخصوص، وقد ثبت أن نسبة الدهون في السلبية، والكولسترول، والدهون الفوسفاتية لتعديل وظيفة pLGIC 8-11. في حين أن الدور الدقيق لهذه المكونات الدهنية في وظيفة القناة لا يزال غير معروف، فإن فهم الجزيئية كاملة من النابضة يتطلب دراسة هذه القنوات في بيئتهم المحلية. سبين موقع الموجه وصفها (SDSL) والكترون ممغطس الرنين (الثوري) الطيفي هي التقنيات من اختيار لدراسة ديناميات البروتين في النظم تشكيلها. الجيش الشعبي الثوري الطيفي لا يقتصر على حجم الجزيئية (كما هو NMR) أو الممتلكات البصرية من العينة (كما هو مضان الطيفي)، وبالتالي يسمح قياسات يبني كامل طول تشكيلها في الظروف الدهون الأم. تقنية حساسة للغاية ولها متطلبات عينة منخفضة نسبيا (في حدود بيكو الخلد). كل من هذه الجوانب تجعل هذه التقنية مناسبة تماما لدراسة بروتينات الغشاء الكبيرة التي يصعب التعبير في أكثر من مليغرامكميات.
وقد تم تطوير استخدام التحليل الطيفي EPR في تركيبة مع زيادة ونقصان وصفها موقع الموجه من قبل واين هوبيل والزملاء، وتم تكييفها لدراسة مجموعة واسعة من أنواع البروتين. وقد استخدمت 12-24 البيانات الثوري للتحقيق في الهياكل الثانوية، والتغيرات في البروتين التشكل، أعماق غشاء الإدراج، والبروتين البروتين / تفاعلات البروتين يجند.
الأسلوب ينطوي على استبدال السيستين في مواقف الفائدة بمقدار الطفرات موقع الموجه. لضمان وضع العلامات الخاصة بالموقع، فمن الضروري أن تكون بديلا cysteines الأصلي مع حامض أميني آخر (على سبيل المثال، سيرين) لإنشاء قالب السيستين أقل. حتى الآن، وتسمية تدور الأكثر شعبية هي MTSL-ثيول محددة: (1-oxyl-2،2،5،5-ميثيل-Δ3-بيرولين-3-الميثيل) methanethiosulfonate التي يعلقها على البروتين من خلال جسر ثاني كبريتيد السندات. نظرا لخصوصيته العالية، وصغر حجمها نسبيا (أكبر قليلا من التربتوفان)، والمرنبيليتي من المنطقة رابط، وقد تبين هذه التسمية تدور لديهم القابلية للتفاعل ممتاز حتى مع وجود السيستين دفن. وعلاوة على ذلك، لتحقيق أقصى قدر من التفاعل، ويتم وضع العلامات رد فعل من البروتين في شكل المنظفات بالفاعلات. بعد انفصال الزائدة حرة تدور التسمية من قبل اللوني حجم الإقصاء، وإعادة تشكيل البروتين في جسيمات شحمية أو أنظمة محاكاة طبقة ثنائية من تكوين الدهون محددة. بشكل عام، والسيستين الطفرات جيد التحمل في معظم أجزاء من البروتين، وحجم صغير نسبيا من زيادة ونقصان مسبار يسبب الحد الأدنى من اضطراب للهياكل الثانوية والثالثية. للتأكد من أن تعديل الاحتفاظ ظائف نوع البرية، وقنوات وصفت وأعيد يمكن دراستها عن طريق القياسات التصحيح، المشبك.
ثم يتعرض البروتين المسمى وظيفية لقياسات الطيفية، والتي توفر أساسا ثلاثة أنواع رئيسية من المعلومات: 12،14،15،20،22،23،25-27 ديناميات تدور التحقيق من قبل lineshتحليل القرد. إمكانية الوصول إلى التحقيق لعوامل الاسترخاء ممغطس. يتم قياس المسافة وتوزيع 27 مسافات الثوري التي كتبها نهجين مختلفين. ويستند أولا على تقنية موجة مستمرة (CW)، حيث الطيفية توسيع الناجمة عن التفاعلات ثنائي القطب بين تدور العلامات (في 8-20 مجموعة بعد). ويستخدم لتحديد مسافة 28،29 والثاني هو نابض-EPR طريقة حيث قياسات المسافة التي يمكن أن تمتد ما يصل الى 70 Å. 30-34 وفي نقرا الكترون الكترون الرنين (غزلان)، ويتم تحليل التذبذبات في السعة تدور الصدى لتحديد المسافات والتوزيعات بعد. هنا هو منظم صدى تدور في وتيرة التفاعل ثنائي القطب. معا، وتستخدم هذه المعايير لتحديد طوبولوجيا البروتين والعناصر الهيكلية الثانوية، والتغيرات البروتين بتكوين.
وقد ثبت الطيفي EPR أن يكون النهج الهيكلي لا مثيل لها في قياس التغيرات متعلق بتكوين بروتينات الغشاء في البيئة القريبة من مسقط رأسه. هذا الأسلوب يتيح لنا نظرة خاطفة في التفاصيل الجزيئية ديناميات البروتين الذي يتم حجب في هياكل عالية الدقة من البلورات بالأشعة السينية وال?…
The authors have nothing to disclose.
ونحن ممتنون جدا لأعضاء الحاليين والسابقين في المختبر Chakrapani للقراءة وتعليقات نقدية على المخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منحة (1R01GM108921) وجمعية القلب الأميركية (NCRP التنمية العلماء غرانت 12SDG12070069) وSC.
Site-Directed Mutagenesis and Cys mutations | |||
10x PfuUltra HF reaction buffer | Agilent Technologies | 600380-52 | |
dNTPS | New England BioLabs Inc | N0447L | 10mM each dNTP |
pfu Ultra DNA polymerase | Agilent Technologies | 600380-51 | 2.5 U/ul |
DPNI | New England BioLabs Inc | R0176S | 20,000 U/ml |
XL10 GOLD | Agilent Technologies | 200314 | |
SOC media | New England BioLabs Inc | B9020S | |
Kanamycin | Fisher Scientfic | BP905 | |
LB media | Invitrogen | 127957084 | |
Miniprep kit | QIAGEN | 27106 | |
C43 competent cells | Lucigen | 60446 | |
Expression and Purification | |||
Glucose | Fisher Scientfic | D16 | |
Tryptone | Fisher Bioreagents | BP1421-500 | |
Yeast extract | Amresco | J850 | |
Glycerol | Fisher Bioreagents | BP229 | |
K2HPO4 | Amresco | 0705 | |
KH2PO4 | Amresco | 0781 | |
IPTG (isopropyl-thio-β-galactoside) | Gold Biotechnology | I2481C25 | |
Trizma Base | Sigma Life Science | T1503 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
DNase I | Sigma Life Science | DN25 | |
PMSF | Amresco | M145 | |
Leupeptine | Amresco | J580 | |
Pepstatin | Amresco | J583 | |
DDM (n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside) | Anatrace | D310S | |
Amylose resin | New England BioLabs Inc | E8021L | |
TCEP | Amresco | K831 | |
EDTA | Fisher Scientfic | BP118 | |
Maltose | Acros Organics | 329915000 | |
Superdex 200GL | GE Healthcare | 17-5175-01 | |
Empty polypropylene Chromatography column | BioRad | 731-1550 | |
Site-Directed Spin Labeling | |||
MTSL (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-3-pyrroline-3-methyl) Methanethiosulfonate | Toronto Reaserch chemicals Inc | O873900 | |
(1-acetoxy-2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrroline-3-methyl) methanethiosulfonate | Toronto Reaserch chemicals Inc | A167900 | |
DMSO | J.T. Baker | 9224-01 | |
Reconstitution | |||
Asolectin lipid | Avanti polar lipids Inc | 541602C | |
Biobeads (Polystyrine beads) | Bio Rad | 152-3920 | |
Methanol | Fisher chemicals | A413 | |
FRET | |||
Fluorescein-maleimide | ThermoFisher Scientific | F-150 | |
Tetramethylrhodamine-maleimide | ThermoFisher Scientific | T-6027 | |
POPC | Avanti polar lipids Inc | 850457C | |
POPG | Avanti polar lipids Inc | 840457C | |
E.Coli polar lipid extract | Avanti polar lipids Inc | 100600C | |
HEPES | Sigma Life Science | H3375 | |
EPR measurement | |||
TPX plastic capillaries | Bruker | ER221 | |
EDDA (Ethylenediamine-N, N'-diacetic acid) | Aldrich | 158186 | |
Ni(OH)2 | Aldrich | 283622 |