Sito-Labeling Spin e EPR spettroscopiche Studi di canali pentamerica ligando-dipendenti Ion

Sandip Basak; Soumili Chatterjee; Sudha Chakrapani

doi:10.3791/54127

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Articolo metodologico

Sito-Labeling Spin e EPR spettroscopiche Studi di canali pentamerica ligando-dipendenti Ion

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DOI:

10.3791/54127

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4 luglio 2016

Sandip Basak¹ , Soumili Chatterjee¹ , Sudha Chakrapani¹^,²

¹Department of Physiology and Biophysics, Case Western Reserve University, ²School of Medicine, Case Western Reserve University

In questo articolo

Sommario

Questo articolo descrive i metodi per l'etichettatura dello spin sito-diretto e la ricostituzione dei canali pentamerici ligando-dipendenti per studi di risonanza paramagnetica elettronica. Questo protocollo può essere adattato a qualsiasi proteina di membrana. Il metodo di ricostituzione qui descritto può essere utilizzato anche per misure di patch-clamp di correnti macroscopiche e a canale singolo in un sistema lipidico definito.

Abstract

Il gating dei canali ionici è un'orchestrazione guidata dallo stimolo dei movimenti delle proteine che porta a transizioni tra stati chiusi, aperti e desensibilizzati. Fondamentale per queste transizioni è la flessibilità intrinseca della proteina, che è modulata in modo critico dalla composizione lipidica di membrana. Per comprendere meglio le basi strutturali della funzione dei canali, è necessario studiare la dinamica delle proteine in un ambiente fisiologico di membrana. La spettroscopia di risonanza paramagnetica elettronica (EPR) è uno strumento importante per caratterizzare le transizioni conformazionali tra gli stati funzionali. Rispetto alla NMR e alla cristallografia a raggi X, le informazioni ottenute dall'EPR sono intrinsecamente di risoluzione inferiore. Tuttavia, a differenza di altre tecniche, nell'EPR non esiste un limite superiore al peso molecolare della proteina, i requisiti del campione sono significativamente inferiori e, cosa più importante, la proteina non è vincolata dalle forze del reticolo cristallino. Pertanto, l'EPR è particolarmente adatta per lo studio di grandi complessi proteici e proteine in sistemi ricostituiti. In questo articolo, discuteremo i protocolli generali per la marcatura dello spin sito-diretto e la ricostituzione della membrana utilizzando come esempio un canale ionico ligando-gated ligando-gated (pLGIC) da Gloeobacter violaceus (GLIC). Verrà descritta una combinazione di approcci EPR a onda continua (CW) e pulsata (Double Electron Electron Resonance-DEER) che consentiranno una caratterizzazione quantitativa completa della dinamica dei canali.

Introduzione

Negli ultimi dieci anni, la comprensione strutturale dei canali ionici ligando-dipendenti pentamerica (pLGIC) è cresciuto in salti e limiti, a causa di una moltitudine di strutture ad alta risoluzione di diversi membri della famiglia. I fattori chiave che hanno portato ai progressi in corso nel settore includono, la scoperta dei canali pLGIC procariote, ^1-3 grandi progressi nella espressione della proteina di membrana eucariotica, ^4-6 e enormi progressi negli approcci determinazione della struttura. ⁷ Queste strutture forniscono un chiaro consenso su la conservazione complessiva dell'architettura tridimensionale pLGIC. Tuttavia, d....