This article describes methods for site-directed spin labeling and reconstitution of pentameric ligand-gated channels for Electron Paramagnetic Resonance studies. This protocol can be adapted for any membrane protein. The reconstitution method described here can also be used for patch-clamp measurements of macroscopic and single-channel currents in a defined lipid system.
Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. Fundamental to these transitions is the intrinsic flexibility of the protein, which is critically modulated by membrane lipid-composition. To better understand the structural basis of channel function, it is necessary to study protein dynamics in a physiological membrane environment. Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy is an important tool to characterize conformational transitions between functional states. In comparison to NMR and X-ray crystallography, the information obtained from EPR is intrinsically of lower resolution. However, unlike in other techniques, in EPR there is no upper-limit to the molecular weight of the protein, the sample requirements are significantly lower, and more importantly the protein is not constrained by the crystal lattice forces. Therefore, EPR is uniquely suited for studying large protein complexes and proteins in reconstituted systems. In this article, we will discuss general protocols for site-directed spin labeling and membrane reconstitution using a prokaryotic proton-gated pentameric Ligand-Gated Ion Channel (pLGIC) from Gloeobacter violaceus (GLIC) as an example. A combination of steady-state Continuous Wave (CW) and Pulsed (Double Electron Electron Resonance-DEER) EPR approaches will be described that will enable a complete quantitative characterization of channel dynamics.
Negli ultimi dieci anni, la comprensione strutturale dei canali ionici ligando-dipendenti pentamerica (pLGIC) è cresciuto in salti e limiti, a causa di una moltitudine di strutture ad alta risoluzione di diversi membri della famiglia. I fattori chiave che hanno portato ai progressi in corso nel settore includono, la scoperta dei canali pLGIC procariote, 1-3 grandi progressi nella espressione della proteina di membrana eucariotica, 4-6 e enormi progressi negli approcci determinazione della struttura. 7 Queste strutture forniscono un chiaro consenso su la conservazione complessiva dell'architettura tridimensionale pLGIC. Tuttavia, due aree principali che sembrano scia dietro sono la caratterizzazione funzionale di questi preparati canale e la descrizione meccanicistica della funzione del canale.
Gating cambiamenti conformazionali sono complessi e si verificano su una distanza di 60 Å lungo la lunghezza del canale e queste transizioni sono ampiamente modulati dalipidi di membrana. In particolare, è stato dimostrato lipidi negativi, colesterolo e fosfolipidi di modulare la funzione di pLGIC 8-11. Mentre il ruolo preciso di questi costituenti lipidici in funzione del canale rimane sconosciuta, una comprensione molecolare completa di gating richiederebbe lo studio di questi canali nel loro ambiente nativo. spettroscopia sito-Spin Labeling (SDSL) e Risonanza paramagnetica elettronica (EPR) sono le tecniche di scelta per studiare la dinamica delle proteine nei sistemi ricostituiti. spettroscopia EPR non è limitata dalla dimensione molecolare (come è NMR) o la proprietà ottica del campione (come è spettroscopia di fluorescenza), e permette quindi misure di costrutti integrali ricostituiti in condizioni native lipidici. La tecnica è estremamente sensibile ed ha requisiti relativamente basse campione (nell'intervallo pico-mole). Entrambi questi aspetti rendono la tecnica adatta per studiare proteine di membrana di grandi dimensioni che sono difficili da esprimere in oltre milligrammile quantità.
L'uso della spettroscopia EPR in combinazione con il sito-diretta etichettatura rotazione è stato sviluppato da Wayne Hubbell e colleghi, ed è stato adattato per studiare una gamma di tipi di proteine. 12-24 dati EPR sono stati utilizzati per indagare strutture secondarie, cambiamenti nella proteina conformazione, profondità di membrana di inserimento, e proteina-proteina / interazioni proteina-ligando.
Il metodo prevede la sostituzione cisteina nelle posizioni di interesse mediante mutagenesi sito-diretta. Per garantire un'etichettatura sito-specifica, è necessario sostituire cisteine nativi con un altro aminoacido (ad es., Serina) per creare un modello cisteina-less. Di gran lunga, l'etichetta di spin più popolare è un MTSL specifica-tiolo: (1-oxyl-2,2,5,5-tetrametil-Δ3-pirrolina-3-metil) methanethiosulfonate che si attacca alla proteina attraverso un ponte legame disolfuro. Grazie alla sua elevata specificità, relativamente piccole dimensioni (leggermente più grande di triptofano), e flexibilità della regione linker, questa etichetta centrifuga ha dimostrato di avere un'ottima reattività anche con una cisteina sepolta. Inoltre, per massimizzare la reattività, la reazione di marcatura della proteina è effettuata sotto forma detergente solubilizzata. Dopo la separazione dell'eccesso libera spin-label per dimensione cromatografia di esclusione, la proteina viene ricostituito in liposomi o sistemi doppio strato-mimando di composizione lipidica definito. In generale, cisteina mutagenesi è ben tollerato nella maggior parte della proteina, e le dimensioni relativamente ridotte dello spin-sonda porta perturbazione minimo per le strutture secondarie e terziarie. Per garantire che la modifica mantenuto funzioni wild type, i canali etichettati e ricostituiti possono essere studiate mediante misurazioni patch-clamp.
La proteina marcata-funzionale è quindi sottoposto a misure spettroscopiche, che forniscono essenzialmente tre tipi principali di informazioni: 12,14,15,20,22,23,25-27 dinamiche spin-sonda lineshanalisi ape; l'accessibilità della sonda ad agenti paramagnetici di rilassamento; e la distanza di distribuzione. 27 distanze EPR sono misurate da due approcci diversi. Il primo si basa sulla tecnica Continuous Wave (CW), dove spettrale allargamento derivanti da interazioni dipolari tra spin-etichette (in 8 – un intervallo di distanze 20). Viene utilizzato per determinare la distanza 28,29 Il secondo è un pulsato EPR metodo in cui le misure di distanza può essere estesa fino a 70 Å. 30-34 in doppio Electron Electron Resonance (cervo), le oscillazioni di ampiezza spin-echo vengono analizzati per determinare le distanze e le distribuzioni di distanza. Qui l'eco di spin è modulato alla frequenza dell'interazione dipolare. Insieme, questi parametri vengono utilizzati per determinare la topologia di proteine, elementi strutturali secondari, e le modifiche delle proteine-conformazionale.
spettroscopia EPR ha dimostrato di essere un approccio strutturale senza precedenti nella quantificazione cambiamenti conformazionali nelle proteine di membrana in un ambiente quasi nativa. Questo approccio ci permette una sbirciatina nei dettagli molecolari di dinamica delle proteine che vengono oscurate in strutture ad alta risoluzione da cristallografia a raggi X e microscopia crioelettronica. Tuttavia, è importante considerare le limitazioni tecniche di questo approccio che può influenzare l'applic…
The authors have nothing to disclose.
Siamo molto grati ai deputati ed ex deputati del laboratorio Chakrapani per la lettura critica e commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health sovvenzione (1R01GM108921) e l'American Heart Association (NCRP Scientist Development Grant 12SDG12070069) e SC.
Site-Directed Mutagenesis and Cys mutations | |||
10x PfuUltra HF reaction buffer | Agilent Technologies | 600380-52 | |
dNTPS | New England BioLabs Inc | N0447L | 10mM each dNTP |
pfu Ultra DNA polymerase | Agilent Technologies | 600380-51 | 2.5 U/ul |
DPNI | New England BioLabs Inc | R0176S | 20,000 U/ml |
XL10 GOLD | Agilent Technologies | 200314 | |
SOC media | New England BioLabs Inc | B9020S | |
Kanamycin | Fisher Scientfic | BP905 | |
LB media | Invitrogen | 127957084 | |
Miniprep kit | QIAGEN | 27106 | |
C43 competent cells | Lucigen | 60446 | |
Expression and Purification | |||
Glucose | Fisher Scientfic | D16 | |
Tryptone | Fisher Bioreagents | BP1421-500 | |
Yeast extract | Amresco | J850 | |
Glycerol | Fisher Bioreagents | BP229 | |
K2HPO4 | Amresco | 0705 | |
KH2PO4 | Amresco | 0781 | |
IPTG (isopropyl-thio-β-galactoside) | Gold Biotechnology | I2481C25 | |
Trizma Base | Sigma Life Science | T1503 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
DNase I | Sigma Life Science | DN25 | |
PMSF | Amresco | M145 | |
Leupeptine | Amresco | J580 | |
Pepstatin | Amresco | J583 | |
DDM (n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside) | Anatrace | D310S | |
Amylose resin | New England BioLabs Inc | E8021L | |
TCEP | Amresco | K831 | |
EDTA | Fisher Scientfic | BP118 | |
Maltose | Acros Organics | 329915000 | |
Superdex 200GL | GE Healthcare | 17-5175-01 | |
Empty polypropylene Chromatography column | BioRad | 731-1550 | |
Site-Directed Spin Labeling | |||
MTSL (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-3-pyrroline-3-methyl) Methanethiosulfonate | Toronto Reaserch chemicals Inc | O873900 | |
(1-acetoxy-2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrroline-3-methyl) methanethiosulfonate | Toronto Reaserch chemicals Inc | A167900 | |
DMSO | J.T. Baker | 9224-01 | |
Reconstitution | |||
Asolectin lipid | Avanti polar lipids Inc | 541602C | |
Biobeads (Polystyrine beads) | Bio Rad | 152-3920 | |
Methanol | Fisher chemicals | A413 | |
FRET | |||
Fluorescein-maleimide | ThermoFisher Scientific | F-150 | |
Tetramethylrhodamine-maleimide | ThermoFisher Scientific | T-6027 | |
POPC | Avanti polar lipids Inc | 850457C | |
POPG | Avanti polar lipids Inc | 840457C | |
E.Coli polar lipid extract | Avanti polar lipids Inc | 100600C | |
HEPES | Sigma Life Science | H3375 | |
EPR measurement | |||
TPX plastic capillaries | Bruker | ER221 | |
EDDA (Ethylenediamine-N, N'-diacetic acid) | Aldrich | 158186 | |
Ni(OH)2 | Aldrich | 283622 |