This article describes methods for site-directed spin labeling and reconstitution of pentameric ligand-gated channels for Electron Paramagnetic Resonance studies. This protocol can be adapted for any membrane protein. The reconstitution method described here can also be used for patch-clamp measurements of macroscopic and single-channel currents in a defined lipid system.
Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. Fundamental to these transitions is the intrinsic flexibility of the protein, which is critically modulated by membrane lipid-composition. To better understand the structural basis of channel function, it is necessary to study protein dynamics in a physiological membrane environment. Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy is an important tool to characterize conformational transitions between functional states. In comparison to NMR and X-ray crystallography, the information obtained from EPR is intrinsically of lower resolution. However, unlike in other techniques, in EPR there is no upper-limit to the molecular weight of the protein, the sample requirements are significantly lower, and more importantly the protein is not constrained by the crystal lattice forces. Therefore, EPR is uniquely suited for studying large protein complexes and proteins in reconstituted systems. In this article, we will discuss general protocols for site-directed spin labeling and membrane reconstitution using a prokaryotic proton-gated pentameric Ligand-Gated Ion Channel (pLGIC) from Gloeobacter violaceus (GLIC) as an example. A combination of steady-state Continuous Wave (CW) and Pulsed (Double Electron Electron Resonance-DEER) EPR approaches will be described that will enable a complete quantitative characterization of channel dynamics.
I løpet av det siste tiåret har den strukturelle forståelsen av penta ligand ionekanaler (pLGIC) vokst i sprang og grensene, på grunn av mengder av høyoppløselige strukturer av flere medlemmer av familien. Viktige faktorer som førte til dagens fremskritt innen inkluderer, oppdagelsen av prokaryote pLGIC kanaler, 1-3 store utvikler i eukaryote membran protein uttrykk, 4-6 og enorm gjennombrudd i strukturbestemmelse tilnærminger. 7 Disse strukturene gi en klar konsensus på den totale bevaring av den tredimensjonale arkitektur av pLGIC. Men to viktige områder som synes å sti bak er funksjonell karakterisering av disse kanal forberedelser og mekanistisk beskrivelse av kanalfunksjon.
Gating konformasjonsendringer er komplekse og forekommer i løpet av en 60 en avstand langs lengden av kanalen, og disse overgangene er i utstrakt moduleres avmembranlipider. Spesielt har negative lipider, kolesterol og fosfolipider blitt vist å modulere funksjon av pLGIC 8-11. Mens den nøyaktige rolle disse lipid bestanddeler i kanalfunksjon er fortsatt ukjent, ville en komplett molekylær forståelse av gating krever studere disse kanalene i sitt opprinnelige miljø. Site-Regissert Spin Merking (SDSL) og Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spektroskopi er de teknikker av valget for å studere protein dynamikk i rekonstituert systemer. EPR-spektroskopi er ikke begrenset av molekylstørrelse (som er NMR) eller den optiske egenskap av prøven (som er fluorescens-spektroskopi), og derved tillater målinger av full-lengde konstruksjonene rekonstituert i native lipid forhold. Teknikken er ekstremt sensitiv og har forholdsvis lave prøve krav (i pico-mol område). Begge disse forhold gjør teknikken godt egnet for å studere store membranproteiner som er vanskelig å uttrykke i løpet av milligrammengder.
Bruken av EPR-spektroskopi i kombinasjon med seterettet spinn Merkingen ble utviklet av Wayne Hubbell og kolleger, og har blitt tilpasset for å studere en rekke proteintyper. 12-24 EPR-data har blitt brukt for å undersøke sekundære strukturer, endringer i protein konformasjon, membran-innføringsdybder, og protein-protein / protein-ligand interaksjoner.
Fremgangsmåten omfatter cystein substitusjon i posisjonene av interesse ved seterettet mutagenese. For å sikre at sete-spesifikk merking, er det nødvendig å erstatte naturlige cysteiner med en annen aminosyre (f.eks., Serin) for å skape en cystein-mindre mal. Langt, er den mest populære spin etiketten en tiol-spesifikke MTSL: (1-oxyl-2,2,5,5-tetra-Δ3-pyrroline-3-metyl) methanethiosulfonate som festes til protein gjennom en disulfidbinding bro. På grunn av sin høye spesifisitet, relativt liten størrelse (litt større enn tryptofan), og flexiheten av den linkerområde, har denne sentrifuge etiketten vist seg å ha utmerket reaktivitet selv med en nedgravd cystein. Videre, for å øke reaktiviteten, er merkingsreaksjonen av proteinet utføres i detergent-solubilisert form. Etter separering av overskytende fri spin-etiketten ved størrelseseksklusjons-kromatografi, er proteinet rekonstituert i liposomer eller bilag-ligne systemer med definert lipid sammensetning. Generelt er cystein mutagenese godt tolerert i de fleste deler av proteinet, og den relativt lille størrelsen på spin-sonden medfører minimal forstyrrelse for de sekundære og tertiære strukturer. For å sikre at modifiseringen beholdes vill-type-funksjoner, kan de merkede og rekonstituerte kanaler studeres av patch-clamp målinger.
Det merkede-funksjonelt protein blir deretter utsatt for spektroskopiske målinger, som i hovedsak gir tre hovedtyper av informasjon: 12,14,15,20,22,23,25-27 spin-probe dynamikk etter lineshape analyse; tilgjengeligheten av proben til paramagnetiske avspenningsmidler; og avstand fordeling. 27 EPR avstander er målt ved to forskjellige metoder. Den første er basert på kontinuerlig bølge (CW) teknikk, hvor spektralutvidelse oppstår fra dipolare interaksjoner mellom ringmerker (i 8-20 avstand range). Brukes til å bestemme avstand 28,29 Den andre er en pulset-EPR metode hvor avstandsmålinger kan forlenges opp til 70 å. 30-34 i Double Electron Electron Resonance (hjort), er svingninger i spin-ekko amplitude analysert for å bestemme avstander og avstands distribusjoner. Her spinn ekko moduleres ved frekvensen til den dipolare interaksjoner. Sammen er disse parametere brukes til å bestemme protein topologi, sekundære strukturelle elementer, og protein-konformasjonelle endringer.
EPR-spektroskopi har vist seg å være en enestående strukturell tilnærming i kvantifisering konformasjonsforandringer endringer i membranproteiner i en tilnærmet opprinnelig miljø. Denne tilnærmingen gir oss en titt inn i de molekylære detaljene for protein dynamikk som er skjult i høy oppløsning strukturer fra røntgenkrystallografi og Cryo-elektronmikroskopi. Det er imidlertid viktig å vurdere de tekniske begrensningene i denne tilnærmingen som kan påvirke den generelle anvendbarhet til andre systemer, og …
The authors have nothing to disclose.
Vi er svært takknemlig til de nåværende og tidligere medlemmer av Chakrapani lab for kritisk lesing og kommentarer på manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health stipend (1R01GM108921) og American Heart Association (NCRP Forsker Development Grant 12SDG12070069) og til SC.
Site-Directed Mutagenesis and Cys mutations | |||
10x PfuUltra HF reaction buffer | Agilent Technologies | 600380-52 | |
dNTPS | New England BioLabs Inc | N0447L | 10mM each dNTP |
pfu Ultra DNA polymerase | Agilent Technologies | 600380-51 | 2.5 U/ul |
DPNI | New England BioLabs Inc | R0176S | 20,000 U/ml |
XL10 GOLD | Agilent Technologies | 200314 | |
SOC media | New England BioLabs Inc | B9020S | |
Kanamycin | Fisher Scientfic | BP905 | |
LB media | Invitrogen | 127957084 | |
Miniprep kit | QIAGEN | 27106 | |
C43 competent cells | Lucigen | 60446 | |
Expression and Purification | |||
Glucose | Fisher Scientfic | D16 | |
Tryptone | Fisher Bioreagents | BP1421-500 | |
Yeast extract | Amresco | J850 | |
Glycerol | Fisher Bioreagents | BP229 | |
K2HPO4 | Amresco | 0705 | |
KH2PO4 | Amresco | 0781 | |
IPTG (isopropyl-thio-β-galactoside) | Gold Biotechnology | I2481C25 | |
Trizma Base | Sigma Life Science | T1503 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
DNase I | Sigma Life Science | DN25 | |
PMSF | Amresco | M145 | |
Leupeptine | Amresco | J580 | |
Pepstatin | Amresco | J583 | |
DDM (n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside) | Anatrace | D310S | |
Amylose resin | New England BioLabs Inc | E8021L | |
TCEP | Amresco | K831 | |
EDTA | Fisher Scientfic | BP118 | |
Maltose | Acros Organics | 329915000 | |
Superdex 200GL | GE Healthcare | 17-5175-01 | |
Empty polypropylene Chromatography column | BioRad | 731-1550 | |
Site-Directed Spin Labeling | |||
MTSL (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-3-pyrroline-3-methyl) Methanethiosulfonate | Toronto Reaserch chemicals Inc | O873900 | |
(1-acetoxy-2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrroline-3-methyl) methanethiosulfonate | Toronto Reaserch chemicals Inc | A167900 | |
DMSO | J.T. Baker | 9224-01 | |
Reconstitution | |||
Asolectin lipid | Avanti polar lipids Inc | 541602C | |
Biobeads (Polystyrine beads) | Bio Rad | 152-3920 | |
Methanol | Fisher chemicals | A413 | |
FRET | |||
Fluorescein-maleimide | ThermoFisher Scientific | F-150 | |
Tetramethylrhodamine-maleimide | ThermoFisher Scientific | T-6027 | |
POPC | Avanti polar lipids Inc | 850457C | |
POPG | Avanti polar lipids Inc | 840457C | |
E.Coli polar lipid extract | Avanti polar lipids Inc | 100600C | |
HEPES | Sigma Life Science | H3375 | |
EPR measurement | |||
TPX plastic capillaries | Bruker | ER221 | |
EDDA (Ethylenediamine-N, N'-diacetic acid) | Aldrich | 158186 | |
Ni(OH)2 | Aldrich | 283622 |