A phénotypage Regimen pour des souris génétiquement modifiées utilisées pour étudier les gènes impliqués dans les maladies humaines du vieillissement
Summary
A reverse-genetics approach to understanding gene families associated with human disease is presented, using mouse as a model system, and the subsequent mouse phenotyping schedule is described. Because mice defective in a gene of interest, HtrA2, manifested Parkinsonian symptoms, the phenotyping regimen is focused on identifying neurological defects.
Abstract
Age-related diseases are becoming increasingly prevalent and the burden continues to grow as our population ages. Effective treatments are necessary to lessen the impact of debilitating conditions but remain elusive in many cases. Only by understanding the causes and pathology of diseases associated with aging, can scientists begin to identify potential therapeutic targets and develop strategies for intervention. The most common age-related conditions are neurodegenerative disorders such as Parkinson’s disease and blindness. Age-related macular degeneration (AMD) is the leading cause of blindness in the elderly. Genome wide association studies have previously identified loci that are associated with increased susceptibility to this disease and identified two regions of interest: complement factor H (CFH) and the 10q26 locus, where the age-related maculopathy susceptibility 2 (ARMS2) and high-temperature requirement factor A1 (HtrA1) genes are located. CFH acts as a negative regulator of the alternative pathway (AP) of the complement system while HtrA1 is an extracellular serine protease. ARMS2 is located upstream of HtrA1 in the primate genome, although the gene is absent in mice. To study the effects of these genes, humanized knock-in mouse lines of Cfh and ARMS2, knockouts of Cfh, HtrA1, HtrA2, HtrA3 and HtrA4 as well as a conditional neural deletion of HtrA2 were generated. Of all the genetically engineered mice produced only mice lacking HtrA2, either systemically or in neural tissues, displayed clear phenotypes. In order to examine these mice thoroughly and systematically, an initial phenotyping schedule was established, consisting of a series of tests related to two main diseases of interest: AMD and Parkinson’s. Genetically modified mice can be subjected to appropriate experiments to identify phenotypes that may be related to the associated diseases in humans. A phenotyping regimen with a mitochondrial focus is presented here alongside representative results from the tests of interest.
Introduction
les maladies liées à l'âge sont de plus en plus répandue dans la société moderne. Comme la science médicale améliore et l'espérance de vie augmente, la population continue de vieillir et le fardeau de ces maladies augmente. Des traitements efficaces sont nécessaires pour réduire l'impact des conditions débilitantes, mais restent difficiles dans de nombreux cas. Seule la compréhension des causes et de la pathologie des maladies associées au vieillissement scientifiques peuvent commencer à identifier des cibles thérapeutiques potentielles et élaborer des stratégies d'intervention. des conditions liées à l'âge communs comprennent des troubles neurodégénératifs tels que la maladie de Parkinson (PD) et la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA). PD est trouble du mouvement le plus courant causé par la neurodégénérescence chez les humains. La plupart des patients parkinsoniens présentent des symptômes tels que tremblements de repos, bradykinésie et la rigidité après 50 ans. L'apparition précoce a également été observée dans environ 10% des cas.
La DMLA est la principale cause de cécité dansles photorécepteurs, les personnes âgées endommageant progressivement et l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) dans l'oeil. La vision centrale est altérée, mais la vision périphérique est généralement affectée. Il existe deux formes de DMLA. Dans la forme «sèche», les dépôts de protéines extracellulaires connus sous forme de drusen entre l'EPR et la membrane de Bruch (BM), conduisant à une atrophie géographique et le flou de la vision centrale. Les "humides" plus sévères forment les résultats de néovascularisation de la choroïde à travers BM dans les couches de l'EPR et de photorécepteurs et peuvent conduire à des hamorrhaging sous la rétine qui provoque des dommages permanents au tissu rétinien. Le génome des études d'association de large ont déjà identifié des loci qui sont associés à une susceptibilité accrue à la maladie et a identifié deux régions d'intérêt: le facteur H du complément (CFH) sur le chromosome 1 et le locus 10q26, où liée à l'âge maculopathie susceptibilité 2 (ARMS2) et à haute température facteur de condition A1 (HtrA1) gènes sont situés 1-5 </sup>. Des combinaisons de ces allèles augmentent la probabilité d' une DMLA d'une manière dépendante de la dose et les SNP spécifiques peuvent être associés soit préférentiellement des formes sèches ou humides , de la DMLA 3-6.
CFH agit comme un régulateur négatif de la voie alternative (AP) du système du complément en inhibant l'activation de C3. Un polymorphisme nucléotidique simple (SNP) a été liée à un risque accru d'AMD, ce qui provoque l' échange de la tyrosine 402 dans l' exon 9 avec histidine en raison d'un T à C substitution 1. Dans la DMLA on pense que le PA est misregulated en raison d'une perte de fonction de CFH, mais si le SNP joue un rôle causal est peu claire. Une hypothèse est que l'histidine chargée positivement est pensé à nier la capacité de CFH à se lier à l' interaction des protéines C-réactive protéine et du sulfate d'héparine 1,7. Des études in vitro de CFH Y402H fournissent des résultats contradictoires sur les différences fonctionnelles entre les variantes, et vivo travail <em> Cfh – / – souris exprimant humanisé CFH est en cours 8. ARMS2 est situé en amont HtrA1 dans le génome des primates, bien que le gène est absent chez la souris. HtrA1 est une sérine-protéase, mais ARMS2 est mal caractérisée. Le déséquilibre de liaison entre les SNP dans le locus AMD associée a rendu difficile de déterminer les contributions au risque de mutations individuelles des gènes dans cette région, mais des travaux récents ont suggéré qu'il est surexpression de HtrA1 plutôt que ARMS2 qui mène à la néovascularisation et dépôts de protéines sous – rétiniens 9-11. Toutefois, la proximité des gènes de ce locus peut permettre des interactions qui ne peuvent pas être étudiés en utilisant des transgènes insérés au hasard.
En plus de la DMLA, la famille HtrA de sérine-protéases ont été associées à de nombreuses maladies humaines. Toutes les protéines HtrA contiennent un domaine de sérine-protéase suivi d'au moins un domaine PDZ C-terminale. HtrA1, HtrA3 et HtrA4 partagent le grmanges d'homologie, se composant d'un domaine de peptide signal, de liaison du facteur ressemblant à l'insuline de croissance, un domaine inhibiteur de protéase Kazal, le domaine de la sérine protéase et un domaine PDZ. HtrA2 a une extrémité N-terminale différente, composée d'une séquence de localisation mitochondriale, un domaine transmembranaire et un inhibiteur de domaine de liaison à l' apoptose suivie par la protéase et les domaines PDZ 12-16. HtrA1 chez les mammifères est régulée par le remodelage induit par le substrat dans le site actif de son domaine de protéase 17-20 et HtrA2 peut aussi être modulée par l' interaction entre la sérine protéase et les domaines PDZ qui supprime l' activité de protease 21. Fait intéressant, le domaine PDZ ne semble pas conférer une réglementation similaire à HtrA3 16. Les protéases HtrA peuvent également être réglementées par des facteurs extrinsèques: il a été récemment démontré qu'il existe une interaction réglementaire entre HtrA1 et protoporphyrines 22 et HtrA2 peuvent être régulées par la phosphorylation lors de l' activation de la kinase MAP p38la voie d'une manière dépendante PINK1 23. La suppression des membres individuels de la famille HtrA chez la souris a été documentée, mais les effets mécanistes sont pour la plupart peu claire en partie à cause du manque de phénotypes visibles.
HtrA1 joue un rôle important dans le contrôle de la qualité de la protéine et de sa mauvaise régulation ou la mutation a été associée à de nombreuses maladies humaines différentes , y compris l' arthrite, le cancer et un risque accru de DMLA 3,4,24-32. Perte de la fonction HtrA2 dans les tissus neuronaux ont été associés à des phénotypes parkinsoniens chez les humains et les souris, tandis que sa perte de tissus non neuraux entraîne un vieillissement accéléré 33-37. HtrA3 dysrégulation a été associée à des maladies telles que la pré – éclampsie et certains types de cancer 38,39. Up-régulation de HtrA4 a été observée dans les placentas de patients atteints de prééclampsie , mais les souris knock – out ne pas afficher un phénotype manifeste 40,41. Le manque de phénotypes observés chez certaines souris knock-out a étépostulé pour être le résultat d' une compensation entre le membre de la famille HtrA: on pense que les deux HtrA4 et HtrA1 interagissent avec la famille des protéines TGF-B, ce qui permet une compensation par HtrA1 sur la suppression de HtrA4 41. De même, on pense que depuis HtrA1 et HtrA3 ont un degré élevé d'homologies de domaine qu'ils peuvent avoir des fonctions complémentaires 42. Cependant, il a été suggéré que les protéines HtrA peuvent avoir un rôle partiellement antagonistes, en concurrence pour réguler 43 cibles communes.
Pour approfondir ces facteurs de risque trois lignées de souris knock-in humanisés ont été générés. Dans Cfh TM1 (CFH * 9) jhoh et Cfh TM2 (CFH * 9) jhoh, exon 9 du gène CFH remplacé par exon 9 de l'homologue humain. Cfh TM1 (CFH * 9) jhoh code pour la non-maladie associée tyrosine résidu en position 402, tandis que Cfh tM2 (CFH * 9) jhoh porte le Y402H, SNP de risque associé. DansARMS2 tm1jhoh la séquence ARMS2 humaine a été la cible d'une région en amont de HtrA1. Une séquence d'arrêt loxP flanquée placé en amont de la séquence du gène , mais en aval du promoteur inclus UBIC a été excisé par croisement des souris OzCre, qui expriment la recombinase Cre sous le contrôle du promoteur Rosa26, 34 comme décrit précédemment. En plus de ces knock-in lignes, allèles knock – out conditionnel pour Cfh et HtrA1 (Cfh tm1jhoh et HtrA1 tm1jhoh), ainsi que les autres membres connus de la famille HtrA ont été générés: HtrA2 (HtrA2 tm1jhoh), HtrA3 (HtrA3 tm1jhoh) et HtrA4 ( HtrA4 tm1jhoh). Les KO lignée germinale ont été créés par le croisement des souris OzCre aux animaux conçus pour flanquer exons spécifiques avec des sites loxP, tels que la suppression provoque un décalage du cadre et / ou suppression du domaine actif (Cfh; exon 3, HtrA1; exons 2-3, HtrA2: exons 2-4, HtrA3; ' exon 3, HtrA4; exons 4-6) 34,41. Une délétion neuronal de HtrA2, supprimé en utilisant Cre recombinase sous le contrôle du promoteur de la nestine (HtrA2 flox; Tg (Nes-cre) 1Kln / J), a également été décrite 34. Seules les souris dépourvues de HtrA2, soit systémique ou dans les tissus neuronaux, affichés phénotypes clairs, présentant des phénotypes parkinsoniens.
Comme certains de ces gènes d'intérêt sont posés à être localisées aux mitochondries 11,44-47, et la suppression de HtrA2 généré phénotypes parkinsoniens, un régime de phénotypage avec un accent mitochondrial et neurologique est décrit ici et des résultats représentatifs des tests d'intérêt sont fournis . Afin d'examiner des souris génétiquement modifiées produites pour enquêter sur l'homme, la maladie liée à l'âge à fond et systématiquement un calendrier de phénotypage initial a été créé, composé d'une série de tests relatifs aux deux principauxmaladies d'intérêt: AMD et de Parkinson.
Protocol
Representative Results
Discussion
traitements robustes sont nécessaires pour limiter l'impact des conditions liées au vieillissement humain débilitante, mais ils restent hors de portée pour de nombreuses conditions. Pour identifier des cibles thérapeutiques potentielles et élaborer des stratégies d'intervention, les causes et la pathologie des maladies associées au vieillissement doivent d'abord être compris. Toutes les souris génétiquement modifiées immédiatement présentes avec des phénotypes clairs qui sont liés à la malad…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le financement de cette recherche provient du Fonds de recherche du doyen Yale Medical School (JH) Foundation et médicale Rosebay. Nous remercions le Dr Claire Koenig pour l'aide avec des expériences comportementales. Génétiquement lignées de souris Engineered ont été générés à Ozgene (Perth, Australie).
Materials
| Ethanol | Decon (Fisher Scientific) | 435541 | |
| 50 ml conical tube | Fisher Scientific | 1443222 | |
| cotton balls | Walmart | ||
| heat mat | Sunbeam | 0000756-500-000 | |
| Holding tray (ice cube tray) | Walmart | ||
| Electronic stopwatch | GOGO | PC396 | |
| Plexiglass box | constructed in workshop | 12" by 12" | |
| Vixia HF R400 Camcorder | Canon | 8155B004 | |
| 9oz Clear Cups | Walmart | ||
| 1/4 inch wire mesh | Home Depot | 204331884 (online) / 554219 (in store) | 12" by 12" |
| Bubble wrap | VWR | 470092-416 | |
| Straight specimen forceps | VWR | 82027-438 | |
| Fine-tip dissecting forceps | VWR | 82027-408 | |
| Fine scissors | VWR | 82027-578 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 10x phosphate buffered saline pH 7.4 | American Bioanalytical | AB11072-04000 | |
| Sucrose | JT Baker | 4072-01 | |
| superfrost slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Hematoxylin Stain Solution | Fisher Scientific (Ricca) | 353016 | |
| Eosin Y Stain Solution | Fisher Scientific (Ricca) | 2845-32 | |
| Tris hydrochloride | Sigma | T3253 | |
| Tris | American Bioanalytical | AB02000-01000 | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate | Sigma | N8129 | |
| Nitrotetrazolium Blue chloride | Sigma | N6876 | |
| Acetone | JT Baker | 9006-05 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9390 | |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma | S2378 | |
| VectaMount aqueous mounting medium | Vector Labs | H-5501-60 | |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-545-M | 60 x 24 mm |
| AxioImager A1 microscope | Zeiss | ||
| Video camera tripod | Amazon | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) | Fischer Scientific | 23730571 | |
| Cryostat Sectioning Machine | Leica | CM1900 | Discontinued but since replaced by CM1950 |
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