Un regime Fenotipizzazione per topi geneticamente modificati utilizzati per studiare geni implicati in malattie umane di invecchiamento
Summary
A reverse-genetics approach to understanding gene families associated with human disease is presented, using mouse as a model system, and the subsequent mouse phenotyping schedule is described. Because mice defective in a gene of interest, HtrA2, manifested Parkinsonian symptoms, the phenotyping regimen is focused on identifying neurological defects.
Abstract
Age-related diseases are becoming increasingly prevalent and the burden continues to grow as our population ages. Effective treatments are necessary to lessen the impact of debilitating conditions but remain elusive in many cases. Only by understanding the causes and pathology of diseases associated with aging, can scientists begin to identify potential therapeutic targets and develop strategies for intervention. The most common age-related conditions are neurodegenerative disorders such as Parkinson’s disease and blindness. Age-related macular degeneration (AMD) is the leading cause of blindness in the elderly. Genome wide association studies have previously identified loci that are associated with increased susceptibility to this disease and identified two regions of interest: complement factor H (CFH) and the 10q26 locus, where the age-related maculopathy susceptibility 2 (ARMS2) and high-temperature requirement factor A1 (HtrA1) genes are located. CFH acts as a negative regulator of the alternative pathway (AP) of the complement system while HtrA1 is an extracellular serine protease. ARMS2 is located upstream of HtrA1 in the primate genome, although the gene is absent in mice. To study the effects of these genes, humanized knock-in mouse lines of Cfh and ARMS2, knockouts of Cfh, HtrA1, HtrA2, HtrA3 and HtrA4 as well as a conditional neural deletion of HtrA2 were generated. Of all the genetically engineered mice produced only mice lacking HtrA2, either systemically or in neural tissues, displayed clear phenotypes. In order to examine these mice thoroughly and systematically, an initial phenotyping schedule was established, consisting of a series of tests related to two main diseases of interest: AMD and Parkinson’s. Genetically modified mice can be subjected to appropriate experiments to identify phenotypes that may be related to the associated diseases in humans. A phenotyping regimen with a mitochondrial focus is presented here alongside representative results from the tests of interest.
Introduction
malattie età-associate stanno diventando sempre più diffusi nella società moderna. Come la scienza medica migliora e aumenta l'aspettativa di vita, la popolazione continua a invecchiare e l'onere di queste malattie cresce. sono necessarie per ridurre l'impatto di condizioni debilitanti trattamenti efficaci ma rimangono sfuggente, in molti casi. Solo attraverso la comprensione delle cause e patologia delle malattie associate con l'invecchiamento possono gli scienziati cominciare a identificare potenziali bersagli terapeutici e sviluppare strategie di intervento. Condizioni legate all'età comuni includono malattie neurodegenerative come il morbo di Parkinson (PD) e la degenerazione maculare legata all'età (AMD). PD è il disturbo del movimento più comune causata da neurodegenerazione negli esseri umani. La maggior parte dei pazienti parkinsoniani mostrano sintomi come tremore a riposo, bradicinesia e la rigidità dopo 50 anni di età. esordio precoce è stato osservato anche in circa il 10% dei casi.
AMD è la principale causa di cecità neigli anziani, progressivamente danneggiando fotorecettori e dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) negli occhi. visione centrale è compromessa ma la visione periferica è generalmente inalterata. Ci sono due forme di AMD. Nella forma "a secco", depositi di proteine extracellulari conosciuti come forma drusen tra l'RPE e la membrana di Bruch (BM), che porta alla atrofia geografica e offuscamento della visione centrale. I più gravi "wet" del modulo risultati di neovascolarizzazione della coroide attraverso BM negli strati RPE e fotorecettori e può portare a hamorrhaging sotto la retina che provoca danni permanenti al tessuto retinico. ampi studi di associazione Genome hanno precedentemente identificato loci che sono associati con una maggiore suscettibilità a questa malattia e ha identificato due regioni di interesse: fattore complemento H (CFH) sul cromosoma 1 e il 10q26 locus, dove l'età-correlate maculopatia suscettibilità 2 (ARMS2) e ad alta temperatura fattore requisito A1 (HtrA1) geni sono localizzati 1-5 </sup>. Le combinazioni di questi alleli aumentano la probabilità di AMD in modo dose-dipendente e SNP specifici possono essere preferenzialmente associate sia con le forme umido oa secco di AMD 3-6.
CFH agisce come regolatore negativo della via alternativa (AP) del sistema del complemento inibendo l'attivazione di C3. Un polimorfismo a singolo nucleotide (SNP) è stato collegato a un aumentato rischio di AMD, causando lo scambio di tirosina 402 in esone 9 con istidina a causa di una T di C sostituzione 1. In AMD si ritiene che l'AP è misregulated causa di una perdita di funzione di CFH ma se l'SNP svolge un ruolo causale è chiaro. Un'ipotesi è che l'istidina carica positiva è pensato per negare la capacità di CFH di legarsi a proteine interagenti proteina C-reattiva ed eparina solfato 1,7. Gli studi in vitro di CFH Y402H di risultati contrastanti sulle differenze funzionali tra le varianti, e in vIVO lavoro in <em> CFH – / – topi che esprimono umanizzato CFH è in corso 8. ARMS2 si trova a monte del HtrA1 nel genoma primate, anche se il gene è assente nei topi. HtrA1 è una serina proteasi, ma ARMS2 è scarsamente caratterizzato. Il linkage disequilibrium fra SNPs nel locus AMD-associato ha reso difficile determinare i contributi al rischio delle singole mutazioni dei geni in questa regione, ma studi recenti hanno suggerito che è sovraespressione di HtrA1 piuttosto che ARMS2 che porta alla neovascolarizzazione e depositi di proteine sottoretiniche 9-11. Tuttavia, la vicinanza dei geni in questo locus può consentire interazioni che non può essere studiata utilizzando transgeni inseriti in modo casuale.
Oltre a AMD, la famiglia HtrA di serina proteasi è stata associata a molte malattie umane. Tutte le proteine HtrA contengono un dominio serina proteasi seguito da almeno un dominio PDZ C-terminale. HtrA1, HtrA3 e HtrA4 condividono la grmangerai omologia, costituito da un dominio peptide segnale, legame del fattore di crescita insulino-simile, un dominio inibitore della proteasi Kazal, il dominio serina proteasi e un dominio PDZ. HtrA2 ha un diverso N-terminale, costituito da una sequenza di localizzazione mitocondriale, dominio transmembrana e inibitore dell'apoptosi dominio di legame seguita dalle proteasi e PDZ domini 12-16. HtrA1 mammiferi è regolata da rimodellamento substrato indotta nel sito attivo della proteasi suo dominio 17-20, e HtrA2 può anche essere modulata dall'interazione tra la proteasi serina e domini PDZ che sopprime l'attività della proteasi 21. È interessante notare che il dominio PDZ non sembra conferire regolamento simile a HtrA3 16. Le proteasi HtrA possono anche essere regolati da fattori estrinseci: è stato recentemente dimostrato che esiste un'interazione regolamentare tra HtrA1 e protoporfirine 22 e HtrA2 possono essere regolati da fosforilazione dopo l'attivazione del p38 MAP chinasipercorso in maniera PINK1-dipendente 23. La cancellazione di singoli membri della famiglia HtrA nei topi è stato documentato, tuttavia gli effetti meccanicistici per lo più non sono chiare in parte a causa della mancanza di fenotipi visibili.
HtrA1 svolge una funzione importante nel controllo di qualità delle proteine e la sua misregulation o mutazione è stata associata a molte malattie umane differenti tra cui l'artrite, cancro e un aumento del rischio di AMD 3,4,24-32. Perdita di funzione HtrA2 nei tessuti neurali è stata associata a fenotipi PD negli esseri umani e topi, mentre la perdita di tessuti risultati non-neuronali in invecchiamento accelerato 33-37. HtrA3 disregolazione è stata associata a malattie, tra cui la preeclampsia e alcuni tipi di cancro 38,39. Up-regolazione di HtrA4 è stato osservato nelle placente dei pazienti preeclampsia, ma topi knockout non visualizzare un fenotipo evidente 40,41. La mancanza di fenotipi osservato in alcuni topi knockout è statopostulato ad essere il risultato di una compensazione tra il membro della famiglia HtrA: si pensa che sia HtrA4 e HtrA1 interagiscono con la famiglia TGF-B di proteine, consentendo la compensazione da HtrA1 sulla cancellazione dei HtrA4 41. Analogamente, si pensa che poiché HtrA1 e HtrA3 hanno un alto grado di omologia dominio potrebbero avere funzioni complementari 42. Tuttavia, è stato suggerito che le proteine HtrA possono avere ruoli parzialmente antagoniste, in competizione per regolare obiettivi comuni 43.
Per approfondire questi fattori di rischio tre linee di topi knock-in umanizzati sono stati generati. In CFH TM1 (CFH * 9) jhoh e CFH TM2 (CFH * 9) jhoh, esone 9 del gene CFH viene sostituito con esone 9 della omologo umano. CFH TM1 (CFH * 9) jhoh codifica per la non-malattia associata tirosina residuo alla posizione 402, mentre CFH TM2 (CFH * 9) jhoh porta il Y402H, SNP rischio associato. InARMS2 tm1jhoh la sequenza ARMS2 umana è stata mirata a una regione a monte del HtrA1. Una sequenza di STOP loxP-fiancheggiato posto a monte della sequenza genica ma valle del promotore UbiC inclusa stato asportato attraversando a topi OzCre, che esprimono Cre ricombinasi sotto il controllo del promotore Rosa26, come descritto in precedenza 34. Oltre a questi knock-in linee, alleli knockout condizionali per CFH e HtrA1 (CFH tm1jhoh e HtrA1 tm1jhoh), così come gli altri membri della nota famiglia HtrA sono stati generati: HtrA2 (HtrA2 tm1jhoh), HtrA3 (HtrA3 tm1jhoh) e HtrA4 ( HtrA4 tm1jhoh). I fori linea germinale sono state create da incrociando topi OzCre agli animali ingegnerizzati per affiancare esoni specifici con siti loxP, in modo tale che l'eliminazione provoca uno spostamento telaio e / o la cancellazione del dominio attiva (CFH; esone 3, HtrA1; esoni 2-3, HTRA2: esoni 2-4, HtrA3; esone 3, HtrA4; esoni 4-6) 34,41. Una delezione neurale della HtrA2, cancellato usando Cre ricombinasi sotto il controllo del promotore Nestin (HtrA2 FLOX; Tg (Nes-cre) 1Kln / J), è stato anche descritto 34. Solo topi privi HtrA2, sia sistemico o nei tessuti neurali, visualizzati fenotipi chiari, presentando con fenotipi parkinsoniani.
Poiché alcuni di questi geni di interesse sono poste ad essere localizzata ai mitocondri 11,44-47, e la cancellazione di HtrA2 generato fenotipi parkinsoniani, un regime di fenotipizzazione con un focus mitocondriale e neurologico è descritto qui e risultati rappresentativi dei test di interesse sono forniti . Per esaminare topi geneticamente ingegnerizzati prodotti per indagare umana, malattie correlate all'età accuratamente e sistematicamente una pianificazione fenotipizzazione iniziale è avvenuta, consistente in una serie di test relativi alle due principalipatologie di interesse: AMD e il Parkinson.
Protocol
Representative Results
Discussion
trattamenti robusti sono necessari per limitare l'impatto di condizioni legate all'invecchiamento umano debilitante, ma rimangono sfuggente per molte condizioni. Per identificare potenziali bersagli terapeutici e sviluppare strategie di intervento, le cause e la patologia di malattie associate con l'invecchiamento devono prima essere capiti. Non tutti i topi geneticamente modificati immediatamente presenti con fenotipi chiari che sono legati alla malattia di interesse, anche se questi geni sono stati precede…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il finanziamento per questa ricerca è venuto dal Rosebay Medical Foundation e un Fondo di ricerca di Yale Medical School Dean (JH). Ringraziamo il Dott Claire Koenig per un aiuto con esperimenti comportamentali. Geneticamente linee del mouse Engineered sono stati generati in Ozgene (Perth, Australia).
Materials
| Ethanol | Decon (Fisher Scientific) | 435541 | |
| 50 ml conical tube | Fisher Scientific | 1443222 | |
| cotton balls | Walmart | ||
| heat mat | Sunbeam | 0000756-500-000 | |
| Holding tray (ice cube tray) | Walmart | ||
| Electronic stopwatch | GOGO | PC396 | |
| Plexiglass box | constructed in workshop | 12" by 12" | |
| Vixia HF R400 Camcorder | Canon | 8155B004 | |
| 9oz Clear Cups | Walmart | ||
| 1/4 inch wire mesh | Home Depot | 204331884 (online) / 554219 (in store) | 12" by 12" |
| Bubble wrap | VWR | 470092-416 | |
| Straight specimen forceps | VWR | 82027-438 | |
| Fine-tip dissecting forceps | VWR | 82027-408 | |
| Fine scissors | VWR | 82027-578 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 10x phosphate buffered saline pH 7.4 | American Bioanalytical | AB11072-04000 | |
| Sucrose | JT Baker | 4072-01 | |
| superfrost slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Hematoxylin Stain Solution | Fisher Scientific (Ricca) | 353016 | |
| Eosin Y Stain Solution | Fisher Scientific (Ricca) | 2845-32 | |
| Tris hydrochloride | Sigma | T3253 | |
| Tris | American Bioanalytical | AB02000-01000 | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate | Sigma | N8129 | |
| Nitrotetrazolium Blue chloride | Sigma | N6876 | |
| Acetone | JT Baker | 9006-05 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9390 | |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma | S2378 | |
| VectaMount aqueous mounting medium | Vector Labs | H-5501-60 | |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-545-M | 60 x 24 mm |
| AxioImager A1 microscope | Zeiss | ||
| Video camera tripod | Amazon | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) | Fischer Scientific | 23730571 | |
| Cryostat Sectioning Machine | Leica | CM1900 | Discontinued but since replaced by CM1950 |
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