التصور-المربوطة السطحية الكبيرة جزيئات الحمض النووي مع الحمض النووي البروتين الفلوري ملزم الببتيد
Summary
We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.
Abstract
Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3′ hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).
Introduction
وقد استخدمت التصور من جزيئات الحمض النووي الكبيرة المربوطة على الزجاج أو حبة الأسطح للتحقيق في التفاعلات الحمض النووي والبروتينات، وديناميات البروتين على الصخور القائمة على الحمض النووي، 1،2 والفيزياء البوليمر. 3،4 منصة لاحد المربوطة جزيئات الحمض النووي كبيرة لديها عدد قليل متميزة المزايا بالمقارنة مع الطرق الحمض النووي تجميد الأخرى. 5 الأولى، وهو جزيء الحمض النووي كبير المربوطة على سطح يحتوي على التشكل العشوائي لفائف الطبيعية دون تدفق القص، والتي هي ذات أهمية حاسمة لبروتين الحمض النووي ملزم بالاعتراف الموقع الملزمة. ثانيا، فمن السهل جدا لتغيير البيئة الكيميائية حول جزيئات الحمض النووي لسلسلة من التفاعلات الإنزيمية في غرفة التدفق. ثالثا، تدفق القص ميكروفلويديك يدفع الحمض النووي الجزيئي تمتد ما يصل الى 100٪ من طول محيط كامل، والتي من الصعب جدا تحقيقه من خلال استخدام استطالة الحمض النووي بديلة النهج مثل تجميد سطح 6 و الحبس نانوية. 7 وstretche بالكاملويقدم د الحمض النووي جزيء أيضا المعلومات الموضعية التي يمكن أن تكون مفيدة لرصد تحركات الأنزيمية على خريطة الجينوم.
ومع ذلك، فإن نهج الحمض النووي الربط لديه عيب حرج في أن الصبغة الإقحام مثل يويو-1 يسبب عموما جزيئات الحمض النووي المربوطة لا بد من كسرها بسهولة بواسطة ضوء مضان الإثارة. عموما، جزيئات الحمض النووي كبيرة يجب أن تكون ملطخة صبغة الفلورسنت لرؤية تحت المجهر الفلورسنت. لهذا الغرض، يويو-1 أو غيرها من الأصباغ سلسلة توتو تستخدم في المقام الأول لأن هذه الأصباغ يتألق فقط عندما يقحم الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل. 8 ومع ذلك، فمن المعروف أن صبغ الإقحام مكرر يسبب الناجم عن ضوء الحمض النووي الصور الانقسام ل من إقحام من fluorophores. 9 علاوة على ذلك، جزيئات الحمض النووي الملون fluorescently المربوطة على سطح أكثر هشاشة منذ التدفقات القص يمكن أن تمارس كسر القوات على التحرك بحرية جزيئات الحمض النووي. لذلك، قمنا بتطوير FP-DBP كرواية DNA-تلطيخ صبغ البروتين لتصوير جزيئات الحمض النووي الكبيرة المربوطة على السطح. وميزة استخدام FP-DBP هو أنه لا يسبب الصور انشقاق من جزيئات الحمض النووي التي فإنه يلزم 10 وبالإضافة إلى ذلك، FP-DBP لا يزيد طول كفاف من الحمض النووي، في حين الأصباغ الإقحام مكرر زيادة طول محيط بنحو 33٪.
هذه طريقة الفيديو يقدم المنهج التجريبي لالربط جزيئات الحمض النووي كبيرة على سطح PEG-البيوتين الشكل 1 يوضح نهج مختلفة من الربط الحمض النووي مع نهايات حادة ونهايات لزجة. وبالتالي، يمكن تطبيق هذه الطريقة تلطيخ إلى أي نوع من جزيء الحمض النووي الشكل 2 يصور التمثيل التخطيطي للجمعية غرفة التدفق التي يمكن السيطرة عليها من قبل ضخ حقنة لتوليد تدفقات القص لتمتد جزيئات الحمض النووي وكذلك لتحميل الكيميائية وانزيم الحلول. يوضح الشكل (3) الميكروسكوب من جزيئات الحمض النووي بكامل طاقتها المربوطة على PEGylatسطح الطبعة 11 وملطخة FP-DBP.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا نقدم منبرا لتصور جزيئات الحمض النووي طويلة البيروكسيديز لترسيخ على الأسطح. لقد ذكرت هذا النهج لجزيئات الحمض النووي المربوطة على سطح البروتين أفيدين المغلفة مع المعقدة البيروكسيديز ألبومين المصل البقري. 6 في النهج السابق، وجدنا القضية الحاسمة من الحمض الن?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Sogang University Research Grant of 201410036.
Materials
| 1. DNA Biotinylation | |||
| 1.1) Biotinylation of blunt-end DNA using Terminal Transferase (TdT) | |||
| Terminal Transferase | New England Biolabs | M0315S | Provided with 10x reaction buffer, 2.5 mM Cobalt chloride |
| Biotin-11-dUTP | Invitrogen | R0081 | Biotin-ddNTP is also available |
| T4GT7 Phage DNA | Nippon Gene | 318-03971 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6758 | EDTA |
| 1.2) Biotinylation of sticky end DNA Using DNA Ligase | |||
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | Provided with 10x reaction buffer |
| Lambda Phage DNA | Bioneer | D-2510 | Also available at New England Biolabs |
| 2. Functionalized Surface Derivatization | |||
| 2.1) Piranha Cleaning | |||
| Coverslip | Marienfeld-Superior | 0101050 | 22×22 mm, No. 1 Thickness |
| Teflon rack | Custom Fabrication | ||
| PTFE Thread Seal Tape | Han Yang Chemical Co. Ltd. | 3032292 | Teflon™ tape |
| Sulferic acid | Jin Chemical Co. Ltd. | S280823 | H2SO4, 95 % Purity |
| Hydrogen peroxide | Jin Chemical Co. Ltd. | H290423 | H2O2, 35 % in water |
| Sonicator | Daihan Scientific Co. Ltd. | WUC-A02H | Table-top Ultrasonic Cleaner |
| 2.2) Aminosilanization on Glass Surface | |||
| N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl] ethylenediamine |
Sigma-Aldrich | 104884 | |
| Glacial Acetic Acid | Duksan Chemicals | 414 | 99 % Purity |
| Methyl Alcohol | Jin Chemical Co. Ltd. | M300318 | 99.9 % Purity |
| Polypropylene Container | Qorpak | PLC-04907 | |
| Ethyl Alcohol | Jin Chemical Co. Ltd. | A300202 | 99.9 % Purity |
| 2.3) PEGylation of the coverslip | |||
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Syringe Filter | Sartorius | 16534———-K | |
| Biotin-PEG-SC | Laysan Bio | Biotin-PEG-SC-5000 | |
| mPEG-SVG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | |
| Acetone | Jin Chemical Co. Ltd. | A300129 | 99 % Purity |
| Microscope Slides | Marienfeld-Superior | 1000612 | ~76x26x1 mm |
| 3. Assembling a Flow Chamber | |||
| Acrylic Support | Custom Fabrication | ||
| Double-sided Tape | 3M | Transparent type | |
| Quick-dry Epoxy | 3M | ||
| Polyethylene Tubing | Cole-Parmer | 06417-11, 06417-21 | |
| Gas Tight 250 µl Syringe | Hamilton | 81165 | |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| 4. Sample Loading into Flow Chamber | |||
| Neutravidin | Thermo Scientific | 31000 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503-5KG | Trizma base |
| Microscope | Olympus | IX70 | |
| EMCCD Camera | Q Imaging | Rolera EM-C2 | |
| Solid-state Laser (488 nm) | Oxxius | LBX488 | |
| Alconox | Alconox Inc. | ||
Riferimenti
- Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct Mechanical Measurements of the Elasticity of Single DNA-Molecules by Using Magnetic Beads. Science. 258 (5085), 1122-1126 (1992).
- Finkelstein, I. J., Visnapuu, M. -. L., Greene, E. C. Single-molecule imaging reveals mechanisms of protein disruption by a DNA translocase. Nature. 468 (7326), 983-987 (2010).
- Doyle, P. S., Ladoux, B., Viovy, J. L. Dynamics of a tethered polymer in shear flow. Phys. Rev. Lett. 84 (20), 4769-4772 (2000).
- Perkins, T. T., Quake, S. R., Smith, D. E., Chu, S. Relaxation of a Single DNA Molecule Observed by Optical Microscopy. Science. 264 (5160), 822-826 (1994).
- Cai, W., et al. Ordered restriction endonuclease maps of yeast artificial chromosomes created by optical mapping on surfaces. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (11), 5164-5168 (1995).
- Kim, Y., Jo, K. Neutravidin coated surfaces for single DNA molecule analysis. Chem. Comm. 47 (22), 6248-6250 (2011).
- Kim, Y., et al. Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length. Lab on a Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).
- Glazer, A. N., Rye, H. S. Stable dye-DNA intercalation complexes as reagents for high-sensitivity fluorescence detection. Nature. 359 (6398), 859-861 (1992).
- Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers. Langmuir. 22 (1), 292-299 (2006).
- Lee, S., et al. DNA binding fluorescent proteins for the direct visualization of large DNA molecules. Nucleic Acids Res. , (2015).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nat Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. J. Vis. Exp. (86), e50549 (2014).
