Visualisering av Surface-tjudrade stora DNA-molekyler med ett fluorescerande protein-DNA-bindande peptid
Summary
We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.
Abstract
Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3′ hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).
Introduction
Visualisering av stora DNA-molekyler bundna på glas eller pärla ytor har använts för att undersöka DNA-protein interaktioner, proteindynamik på DNA-substratet, 1,2 och polymerfysik. 3,4 En plattform för enkel-bundna stora DNA-molekyler har ett par distinkta fördelar jämfört med andra DNA-immobiliseringsmetoder. 5 för det första, en stor DNA-molekyl tjudrad på ytan har en naturlig random-coil konforma utan skjuvning flöde, vilket är av avgörande betydelse för ett DNA-bindande protein för att känna igen dess bindningsställe. Det andra är det mycket lätt att ändra den kemiska miljön runt DNA-molekyler för en serie av enzymatiska reaktioner i en flödeskammare. För det tredje, framkallar en mikroflödes skjuvflöde DNA molekyl sträcker sig upp till 100% av hela konturlängden, vilket är mycket svårt att uppnå med hjälp av alternativa DNA förlängning närmar såsom ytan immobilisering 6 och nanochannel förlossning. 7 En fullt stretched DNA-molekyl ger också lägesinformation som kan vara användbar för att övervaka enzymatiska rörelser på den genomiska kartan.
Icke desto mindre har de DNA-sammanlänkning tillvägagångssätt en kritisk brist i att den interkalerande färgämne, såsom YOYO-1 i allmänhet orsakar tjudrade DNA-molekyler att lätt brytas genom fluorescens excitationsljus. I allmänhet, stora DNA-molekyler måste färgas med ett fluorescerande färgämne för visualisering under ett fluorescerande mikroskop. För detta ändamål, YOYO-1 eller andra TOTO serie färgämnen används främst eftersom dessa färgämnen fluorescerar endast när de intercalate dubbelsträngat DNA. 8 Det är emellertid väl känt att bis-interkalerande färg orsakar Ijusinducerad DNA foto klyvning eftersom av interkalering av fluoroforer. 9 Vidare fluorescerande färgade DNA-molekyler bundna på ytan är bräckligare eftersom skjuvning flöden kan utöva bryta krafter på fritt rörliga DNA-molekyler. Därför har vi utvecklat FP-DBP som en roman DNA-färgning protein färgämne för avbildning av stora DNA-molekyler bundna på ytan. Fördelen med att använda FP-DBP är att den inte orsakar foto klyvning av DNA-molekyler till vilka den binder. 10 Dessutom har FP-DBP inte öka den konturlängd av DNA, medan bis-interkalerande färgämnen öka konturlängden med cirka 33%.
Denna video metod introducerar experimentell metod för att tjudra stora DNA-molekyler till en PEG-biotin yta. Figur 1 visar olika metoder för uppbundna DNA med trubbiga ändar och klibbiga ändar. Sålunda kan denna färgningsmetod tillämpas på vilken som helst typ av DNA-molekyl. Figur 2 visar en schematisk representation av flödet kammarenheten som kan styras av en sprutpump för att generera skjuvning flöden för att sträcka DNA-molekyler såväl som att ladda kemiska och enzym lösningar. Figur 3 visar mikrofotografier av helt sträckta DNA-molekyler bundna på PEGylated yta 11 och färgades med FP-DBP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här presenterar vi en plattform för att visualisera långa DNA-molekyler biotinylerade för förankring på ytor. Vi har rapporterat en metod för DNA-molekyler bundna på en avidin protein belagd yta med biotinylerad bovinserumalbumin. 6 I den tidigare strategin, fann vi en avgörande fråga om DNA foto klyvning orsakad av bis-interkala färgämnen som färgas DNA-molekyler bundna på yta. Eftersom dessa ständigt exciterade fluoroforer har en hög sannolikhet för att attackera en DNA-fosfatryggraden, <su…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Sogang University Research Grant of 201410036.
Materials
| 1. DNA Biotinylation | |||
| 1.1) Biotinylation of blunt-end DNA using Terminal Transferase (TdT) | |||
| Terminal Transferase | New England Biolabs | M0315S | Provided with 10x reaction buffer, 2.5 mM Cobalt chloride |
| Biotin-11-dUTP | Invitrogen | R0081 | Biotin-ddNTP is also available |
| T4GT7 Phage DNA | Nippon Gene | 318-03971 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6758 | EDTA |
| 1.2) Biotinylation of sticky end DNA Using DNA Ligase | |||
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | Provided with 10x reaction buffer |
| Lambda Phage DNA | Bioneer | D-2510 | Also available at New England Biolabs |
| 2. Functionalized Surface Derivatization | |||
| 2.1) Piranha Cleaning | |||
| Coverslip | Marienfeld-Superior | 0101050 | 22×22 mm, No. 1 Thickness |
| Teflon rack | Custom Fabrication | ||
| PTFE Thread Seal Tape | Han Yang Chemical Co. Ltd. | 3032292 | Teflon™ tape |
| Sulferic acid | Jin Chemical Co. Ltd. | S280823 | H2SO4, 95 % Purity |
| Hydrogen peroxide | Jin Chemical Co. Ltd. | H290423 | H2O2, 35 % in water |
| Sonicator | Daihan Scientific Co. Ltd. | WUC-A02H | Table-top Ultrasonic Cleaner |
| 2.2) Aminosilanization on Glass Surface | |||
| N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl] ethylenediamine |
Sigma-Aldrich | 104884 | |
| Glacial Acetic Acid | Duksan Chemicals | 414 | 99 % Purity |
| Methyl Alcohol | Jin Chemical Co. Ltd. | M300318 | 99.9 % Purity |
| Polypropylene Container | Qorpak | PLC-04907 | |
| Ethyl Alcohol | Jin Chemical Co. Ltd. | A300202 | 99.9 % Purity |
| 2.3) PEGylation of the coverslip | |||
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Syringe Filter | Sartorius | 16534———-K | |
| Biotin-PEG-SC | Laysan Bio | Biotin-PEG-SC-5000 | |
| mPEG-SVG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | |
| Acetone | Jin Chemical Co. Ltd. | A300129 | 99 % Purity |
| Microscope Slides | Marienfeld-Superior | 1000612 | ~76x26x1 mm |
| 3. Assembling a Flow Chamber | |||
| Acrylic Support | Custom Fabrication | ||
| Double-sided Tape | 3M | Transparent type | |
| Quick-dry Epoxy | 3M | ||
| Polyethylene Tubing | Cole-Parmer | 06417-11, 06417-21 | |
| Gas Tight 250 µl Syringe | Hamilton | 81165 | |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| 4. Sample Loading into Flow Chamber | |||
| Neutravidin | Thermo Scientific | 31000 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503-5KG | Trizma base |
| Microscope | Olympus | IX70 | |
| EMCCD Camera | Q Imaging | Rolera EM-C2 | |
| Solid-state Laser (488 nm) | Oxxius | LBX488 | |
| Alconox | Alconox Inc. | ||
Riferimenti
- Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct Mechanical Measurements of the Elasticity of Single DNA-Molecules by Using Magnetic Beads. Science. 258 (5085), 1122-1126 (1992).
- Finkelstein, I. J., Visnapuu, M. -. L., Greene, E. C. Single-molecule imaging reveals mechanisms of protein disruption by a DNA translocase. Nature. 468 (7326), 983-987 (2010).
- Doyle, P. S., Ladoux, B., Viovy, J. L. Dynamics of a tethered polymer in shear flow. Phys. Rev. Lett. 84 (20), 4769-4772 (2000).
- Perkins, T. T., Quake, S. R., Smith, D. E., Chu, S. Relaxation of a Single DNA Molecule Observed by Optical Microscopy. Science. 264 (5160), 822-826 (1994).
- Cai, W., et al. Ordered restriction endonuclease maps of yeast artificial chromosomes created by optical mapping on surfaces. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (11), 5164-5168 (1995).
- Kim, Y., Jo, K. Neutravidin coated surfaces for single DNA molecule analysis. Chem. Comm. 47 (22), 6248-6250 (2011).
- Kim, Y., et al. Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length. Lab on a Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).
- Glazer, A. N., Rye, H. S. Stable dye-DNA intercalation complexes as reagents for high-sensitivity fluorescence detection. Nature. 359 (6398), 859-861 (1992).
- Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers. Langmuir. 22 (1), 292-299 (2006).
- Lee, S., et al. DNA binding fluorescent proteins for the direct visualization of large DNA molecules. Nucleic Acids Res. , (2015).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nat Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. J. Vis. Exp. (86), e50549 (2014).
