Meget følsomme og Rapid Fluorescens Detection med en bærbar FRET Analyzer

Summary

Denne protokol beskriver den hurtige og meget følsomme kvantificering af Förster resonans (FRET) sensor data ved hjælp af en skræddersyet bærbar FRET analysator. Indretningen blev anvendt til at detektere maltose inden en kritisk temperaturområde, der maksimerer afsløring følsomhed, der gør det muligt praktisk og effektiv vurdering af indhold af sukker.

Abstract

Nylige forbedringer i Förster resonans (FRET) sensorer har aktiveret deres anvendelse til at opdage forskellige små molekyler, herunder ioner og aminosyrer. Men den medfødte svagt signal intensitet FRET sensorer er en stor udfordring, der forhindrer deres anvendelse i forskellige områder og gør brug af dyre, high-end fluorometre nødvendig. Vi har tidligere bygget en omkostningseffektiv, højtydende FRET analysator, som specifikt kan måle forholdet mellem to emissioner bølgelængdebånd (530 og 480 nm) for at opnå en høj detektionsfølsomhed. For nylig blev det opdaget, at FRET sensorer med bakteriel periplasmiske bindingsproteiner detektere ligander med maksimal følsomhed i det kritiske temperaturområde på 50 – 55 ° C. Denne rapport beskriver en protokol til vurdering sukkerindhold i kommercielt tilgængelige drikkevarer prøver at bruge vores bærbare FRET analysator med en temperatur-specifik FRET sensor. Vores resultater viste, at den yderligere forvarmningFremgangsmåden FRET sensor øger FRET forholdssignal, at muliggøre en mere nøjagtig måling af indhold af sukker. Den specialfremstillede FRET analysator og sensor blev anvendt med held til at kvantificere sukkerindholdet i tre typer af kommercielle drikkevarer. Vi forventer, at yderligere reduktion og ydeevne størrelse forøgelse af udstyret vil lette brugen af ​​håndholdte analysatorer i miljøer, hvor high-end udstyr er ikke tilgængelig.

Introduction

Forster-resonansenergioverførsel (FRET) er blevet almindeligt anvendt som en biometrisk sensor til at detektere små molekyler, såsom sukkerarter, calciumioner og aminosyrer ^1-4. FRET biosensorer indeholder fluorescerende proteiner, cyan fluorescerende proteiner (CFPS) og gul fluorescerende proteiner (YFPs), som er kondenseret til begge ender af periplasmatiske-proteiner (PBP). Sukkerarter binder til PBP placeret i midten af ​​FRET sensor, forårsager strukturelle ændringer af sensor, der efterfølgende ændrer afstanden og overgang dipol orientering af de to fluorescerende proteiner i hver ende af PBP. Denne ændring muliggør kvantitativ analyse af sukkerindholdet ved at måle forholdet mellem emissions- bølgelængder EYFP (530 nm) og ECFP (480 nm). På grund af den høje følsomhed, specificitet, real-time overvågning kapacitet, og hurtig responstid på FRET biosensorer, er disse sensorer er meget udbredt i miljøet, industrielle og medicinske anvendelser ^5. Desuden ratiometric måling med FRET biosensorer har vigtige praktiske fordele, da den kan anvendes til at måle bestanddele i komplekse biologiske prøver, hvor koncentrationen sensoren ikke let kan kontrolleres og baggrundsfluorescens er altid til stede.

På trods af disse fordele ved FRET-baserede sensorer til kvantitativ visualisering, små strukturelle ændringer med ufuldstændig domæne motion-overførsel til de fluorescerende proteiner producerer inhærent svagt signal intensitet. Dette svage signal begrænser anvendelsen af FRET-baserede sensorer til in vitro eller in vivo-analyse ^6. Derfor kan de fleste FRET biosensorer kræver brug af dyre og meget følsomt udstyr. Vi har tidligere udviklet en billig og bærbar FRET analysator med kapaciteter svarende til dem af de eksisterende fluorescens analysatorer ^7. I denne anordning billige 405-nm båndet ultraviolet lysemitterende diode (LED) blev anvendt som lyskilde til at forårsage excitation af the fluorescenssignal, der erstatter et dyrt lampe eller laser. Detekteringssystemet af analysatoren effektivt fokuserer utrættende fluorescenssignalet på to fotodetektorer med en silicium fotodiode. I en nyere undersøgelse, viste vi, at optimering af afsløring temperatur ved 50 – 55 ° C i væsentlig grad kan forstørre ratiometrisk FRET signal ^8. Denne temperatur-specifikke signal ekstraudstyr, sammen med specialfremstillede FRET analysator, muliggør anvendelse af FRET sensorer i mere generelle diagnostiske applikationer med hurtig og høj følsomhed.

I denne protokol, demonstrerede vi den generelle anvendelighed af den FRET analysator under optimale FRET temperaturforhold ved at kvantificere indholdet af kommercielt tilgængelige drikkevarer sukker. Denne protokol giver detaljerne i FRET enhedens drift, samt en kort beskrivelse af sensor og prøveforberedelse. Vi forventer, at denne rapport vil fremme den potentielle anvendelse af bærbareanalysator i små laboratoriemiljøer og give et grundlag for yderligere udvikling af en billig on-site diagnostiske enhed med FRET-baserede biosensorer.

Protocol

1. Fremstilling af biosensor Konstruktion af plasmidet pET21a (+) – CFP-MBP-YFP-His6 ved at følge den tidligere etablerede protokol 2. Inokulere 5 ml Luria-bouillon (LB) med en enkelt koloni af en Escherichia coli DE3-stammen og inkuberes ved 37 ° C i 16 timer under omrystning. Overføres 1 ml O / N-kulturen til en 500 ml kolbe indeholdende 100 ml LB og inkuber ved 37 ° C i en rysteinkubator, indtil den optiske densitet ved 600 nm (OD600) når 0,5 (ca. 3 t…

Representative Results

For at udføre kvantitativ analyse af sukker indhold ved hjælp af FRET analysatoren, er det nødvendigt at bygge en tilpassede kurve estimering koncentration målet sukker fra den observerede FRET ratio. Lad r definere forholdet mellem emissionsintensitet FFP ved 480 nm, og emissionsintensitet YFP genereret ved 530 nm (Eq. 1). <p class="jove_c…

Discussion

Denne protokol muliggør hurtig og effektiv kvantificering af sukkerindholdet i prøver drik ved hjælp af en skræddersyet FRET analysator ⁷ ved en optimal temperatur for FRET sensorer. Analysatoren er designet med en nyligt udviklede, billig 405-nm båndet ultraviolet-LED som lyskilde og to fotodetektorer med en silicium fotodiode. Denne enhed er mere omkostningseffektiv end andre sammenlignelige fluorometre. Indretningen udviste høj detekteringssensitivitet, specielt ved måling af forholdet mellem to emi…

Materials

LB	BD	#244620
isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG)	Sigma	I6758
Ampicillin	Sigma	A9518
Tri-HCl	Bioneer	C-9006-1
PMSF	Sigma	78830
EDTA	Bioneer	C-9007
DTT	Sigma	D0632
NaCl	Junsei	19015-0350
phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	70011-044	0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4
SOC			2% tryptone, 0.5% Yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MGCl2, 20 mM Glucose
Resource Q	Amersham Biosciences	17-1177-01	6 × 30 mm anion-exchange chromatography column
HisTrap HP1	Amersham Biosciences	29-0510-21
Quartz cuvette	Sigma	Z802875
AKÄKTAFPLC	Amersham Biosciences	18-1900-26	a fast protein liquid chromatography (FPLC)
Cary Eclipse	VarianInc		a fluorescence spectrophotometer
VICTOR	PerkinElmer	2030-0050	a multilabel plate reader
E. coli JM109 (DE3)	Promega		Electrocompetent cells
A (Beverage)	Korea Yakult Co. (Korea)	Birak	Fermented drinks
B (Beverage)	Lotte Foods (Korea)	Epro	Soft drink
C (Beverage)	Lotte Foods (Korea)	Getoray	Sports drink