Mycket känslig och snabb fluorescensdetektion med en bärbar FRET Analyzer
Summary
Detta protokoll beskriver den snabba och mycket känsliga kvantifiering av Förster resonansenergiöverföring (FRET) sensordata med hjälp av en skräddarsydd bärbar FRET analysator. Anordningen användes för att detektera maltos inom ett kritiskt temperaturområde som maximerar detektionskänslighet, vilket möjliggör praktisk och effektiv bedömning av sockerinnehåll.
Abstract
De senaste förbättringarna i Förster resonans energiöverföring (FRET) sensorer har möjliggjort deras användning för att upptäcka olika små molekyler inklusive joner och aminosyror. Men den inneboende svag signalintensiteten av FRET sensorer en stor utmaning som förhindrar deras tillämpning inom olika områden och gör användningen av dyra, high-end fluorometrar nödvändigt. Tidigare byggde vi en kostnadseffektiv, högpresterande FRET analysator som specifikt kan mäta förhållandet mellan två emissionsvåglängdsband (530 och 480 nm) för att uppnå hög detektionskänslighet. På senare tid har det visat sig att FRET sensorer med bakteriell periplasmatiska bindningsproteiner upptäcka ligander med maximal känslighet i det kritiska temperaturområdet 50-55 ° C. Denna rapport beskriver ett protokoll för att bedöma sockerinnehåll i kommersiellt tillgängliga dryckes prover med hjälp av våra bärbara FRET analysator med en temperatur specifik FRET sensor. Våra resultat visade att den ytterligare förvärmningFörfarandet enligt FRET sensorn ökar avsevärt FRET förhållandesignalen, för att möjliggöra mer noggrann mätning av sockerinnehåll. Den skräddarsydda FRET analysator och sensor har framgångsrikt tillämpats för att kvantifiera sockerhalten i tre typer av kommersiella drycker. Vi räknar med att ytterligare storleksminskning och förbättring av utrustningen kommer att underlätta användningen av handhållna analysatorer i miljöer där high-end utrustning inte är tillgänglig.
Introduction
Förster resonansenergiöverföring (FRET) har i stor utsträckning används som en biometrisk sensor för att detektera små molekyler såsom sockerarter, kalciumjoner och aminosyror 1-4. FRET biosensorer innehåller fluorescerande proteiner, cyan fluorescerande proteiner (CFPS) och gula fluorescerande proteiner (YFPs), vilka är kondenserade till båda ändar av periplasmatiska bindande proteiner (PBP). Sockerarter binder till PBP är belägna i mitten av FRET sensorn, vilket orsakar strukturella förändringar av sensor som därefter förändra avståndet och övergång dipol orienteringen av de två fluorescerande proteiner vid vardera änden av PBP. Denna förändring möjliggör kvantitativ analys av sockerinnehållet genom att mäta förhållandet mellan emissionsvåglängder på EYFP (530 nm) och ECFP (480 nm). På grund av den höga känslighet, specificitet, övervakning i realtid kapacitet, och snabb svarstid FRET biosensorer, är dessa sensorer används ofta i miljö, industriella och medicinska tillämpningar 5. Dessutom ratiometric mätning med FRET biosensorer har viktiga praktiska fördelar, eftersom det kan användas för att mäta komponenter i komplexa biologiska prover där givaren koncentrationen inte kan lätt kontrolleras och bakgrundsfluorescens är alltid närvarande.
Trots dessa fördelar med FRET-baserade sensorer för kvantitativ visualisering, små strukturella förändringar med ofullständig domänrörelse överföring till fluorescerande proteiner producerar sig svag signalstyrka. Den svaga signal begränsar tillämpningen av FRET-baserade sensorer för in vitro eller in vivo analys 6. Således kan flertalet FRET biosensorer kräver användning av dyra och mycket känslig utrustning. Tidigare har vi utvecklat en billig och portabel FRET analysator med funktioner som liknar de hos existerande fluorescensanalys 7. I denna anordning, billig 405-nm band ultraviolett ljus-emitterande diod (LED) användes som ljuskälla för att orsaka excitation av the fluorescenssignal, som ersätter en dyr lampa eller laser. Systemet med analysatorns detektions fokuserar effektivt den avledande fluorescenssignalen på två fotodetektorer med en kiselfotodiod. I en senare studie visade vi att optimering av detektionstemperatur på 50-55 ° C avsevärt skulle kunna förstora ratiometrisk FRET signalen 8. Denna temperatur-specifika signalförstärkning, tillsammans med skräddarsydd FRET analysator, möjliggör användning av FRET sensorer i mer allmänna diagnostiska tillämpningar med snabb och hög känslighet.
I detta protokoll, visade vi den allmänna tillämpligheten av FRET analysatorn under optimala förhållanden FRET temperaturskillnader genom att kvantifiera halten av kommersiellt tillgängliga drycker socker. Detta protokoll ger detaljerna i FRET enhetens funktion, samt en kort beskrivning av sensorn och provberedning. Vi räknar med att denna rapport kommer att främja den potentiella tillämpningen av den bärbaraanalysator i småskaliga laboratoriemiljöer och ge en grund för vidare utveckling av en billig på plats diagnosanordningen med FRET-baserade biosensorer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll möjliggör snabb och effektiv kvantifiering av sockerhalten i dryckes prover, med hjälp av en skräddarsydd FRET analysator 7 vid en optimal temperatur för FRET sensorer. Analysatorn har utformats med en nyligen utvecklad, billig 405 nm band ultraviolett LED som ljuskälla och två fotodetektorer med en kiselfotodiod. Denna enhet är mer kostnadseffektiv än andra jämförbara fluorometrar. Anordningen visade hög detektionskänslighet, särskilt vid mätning av förhållandet mellan två e…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning har finansierats med bidrag från Intelligent Syntetisk biologi Center of Global Frontier Project (2011-0031944) och KRIBB Research Initiative Program.
Materials
| LB | BD | #244620 | |
| isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) | Sigma | I6758 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Tri-HCl | Bioneer | C-9006-1 | |
| PMSF | Sigma | 78830 | |
| EDTA | Bioneer | C-9007 | |
| DTT | Sigma | D0632 | |
| NaCl | Junsei | 19015-0350 | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4 |
| SOC | 2% tryptone, 0.5% Yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MGCl2, 20 mM Glucose | ||
| Resource Q | Amersham Biosciences | 17-1177-01 | 6 × 30 mm anion-exchange chromatography column |
| HisTrap HP1 | Amersham Biosciences | 29-0510-21 | |
| Quartz cuvette | Sigma | Z802875 | |
| AKÄKTAFPLC | Amersham Biosciences | 18-1900-26 | a fast protein liquid chromatography (FPLC) |
| Cary Eclipse | VarianInc | a fluorescence spectrophotometer | |
| VICTOR | PerkinElmer | 2030-0050 | a multilabel plate reader |
| E. coli JM109 (DE3) | Promega | Electrocompetent cells | |
| A (Beverage) | Korea Yakult Co. (Korea) | Birak | Fermented drinks |
| B (Beverage) | Lotte Foods (Korea) | Epro | Soft drink |
| C (Beverage) | Lotte Foods (Korea) | Getoray | Sports drink |
Riferimenti
- Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering. Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).
- Ha, J. S., Song, J. J., Lee, Y. M., Kim, S. J., Sohn, J. H., Shin, C. S., Lee, S. G. Design and application of highly responsive fluorescence resonance energy transfer biosensors for detection of sugar in living Saccharomyces cerevisiae cells. Appl. Environ. Microbiol. 73 (22), 7408-7414 (2007).
- Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (29), 10554-10559 (2004).
- Okumoto, S., Looger, L. L., Micheva, K. D., Reimer, R. J., Smith, S. J., Frommer, W. B. Detection of glutamate release from neurons by genetically encoded surface-displayed FRET nanosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (24), 8740-8745 (2005).
- Merzlyakov, M., Li, E., Casas, R., Hristova, K. Spectral Förster resonance energy transfer detection of protein interactions in surface-supported bilayers. Langmuir. 22 (16), 6986-6992 (2006).
- Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).
- Kim, H., Kim, H. S., Ha, J. S., Lee, S. G. A portable FRET analyzer for rapid detection of sugar content. Analyst. 140 (10), 3384-3389 (2015).
- Gam, J., Ha, J. -. S., Kim, H., Lee, D. -. H., Lee, J., Lee, S. -. G. Ratiometric analyses at critical temperatures can magnify the signal intensity of FRET-based sugar sensors with periplasmic binding proteins. Biosens. Bioelectron. 72, 37-43 (2015).
- Hessels, A. M., Merkx, M. Genetically-encoded FRET-based sensors for monitoring Zn2+ in living cells. Metallomics. 7 (2), 258-266 (2015).
- Song, Y., Yang, M., Wegner, S. V., Zhao, J., Zhu, R., Wu, Y., He, C., Chen, P. R. A genetically encoded FRET sensor for intracellular heme. ACS Chem. Biol. 10 (7), 1610-1615 (2015).
- . Fluorescent Protein Guide: Biosensors Available from: https://www.addgene.org/fluorescent-proteins/biosensors/ (2015)
- Rajendran, R., Rayman, G. Point-of-care blood glucose testing for diabetes care in hospitalized patients: an evidence-based review. J. Diabetes Sci. Technol. 8 (6), 1081-1090 (2014).
- Vyas, N. K., Vyas, M. N., Quiocho, F. A. Sugar and signal-transducer binding sites of the Escherichia coli galactose chemoreceptor protein. Science. 242, 1290-1295 (1988).
- Leermakers, E. T. M., Felix, J. F., Erler, N. S., Ċerimagić, A., Wijtzes, A. I., Hofman, A., Raat, H., Moll, H. A., Rivadeneira, F., Jaddoe, V. W., Franco, O. H., Kiefte-de Jong, J. C. Sugar-containing beverage intake in toddlers and body composition up to age 6 years: The Generation R Study. Eur. J. Clin. Nutr. 69 (3), 314-321 (2015).
- Shilts, M., Styne, D., Drake, C., Aden, C., Townsend, M. Fast food, fat and sugar sweetened beverage items are related to children’s dietary energy density. FASEB J. 29 (1), 731-736 (2015).
- Larsson, S. C., Åkesson, A., Wolk, A. Sweetened beverage consumption is associated with increased risk of stroke in women and men. J Nutr. 144 (6), 856-860 (2014).
- Melkko, S., Neri, D., Vaillancourt, P. E. Calmodulin as an affinity purification tag. E. coli Gene Expression Protocols. , 69-77 (2003).
