Altamente sensibile e rapido fluorescenza Detection con un portatile FRET Analyzer

Sommario

Questo protocollo descrive la quantificazione rapida e altamente sensibile di Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) i dati dei sensori utilizzando un analizzatore portatile FRET su misura. Il dispositivo è stato utilizzato per rilevare maltosio in un intervallo di temperatura critica che massimizza sensibilità di rilevamento, consentendo valutazione pratica ed efficiente del contenuto di zucchero.

Abstract

Recenti miglioramenti nella Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) sensori hanno consentito il loro uso per rilevare varie piccole molecole tra ioni e aminoacidi. Tuttavia, l'intensità innata debole segnale di sensori FRET è una sfida importante che impedisce loro applicazione in vari campi e rende l'uso di costosi, di fascia alta Fluorimetro necessario. In precedenza, abbiamo costruito un analizzatore FRET ad alte prestazioni conveniente che possono specificatamente misurare il rapporto di due bande di lunghezza d'onda di emissione (530 e 480 nm) per ottenere un'elevata sensibilità di rilevamento. Più recentemente, si è scoperto che i sensori FRET con periplasmatiche batterica proteine ​​leganti rilevano ligandi con la massima sensibilità nel range di temperatura critica di 50 - 55 ° C. Questo rapporto descrive un protocollo per la valutazione zucchero contenuto nei campioni di bevande disponibili in commercio utilizzando il nostro analizzatore FRET portatile con un sensore FRET specifica temperatura. I nostri risultati hanno dimostrato che la scaldaprocesso del sensore FRET aumenta significativamente il segnale di rapporto FRET, per consentire la misura più accurata del contenuto di zucchero. L'analizzatore e sensore FRET su misura sono state applicate con successo per quantificare il contenuto di zucchero in tre tipi di bevande commerciali. Prevediamo che un'ulteriore riduzione dimensioni e prestazioni valorizzazione delle apparecchiature faciliterà l'utilizzo di analizzatori portatili in ambienti in cui le apparecchiature high-end non è disponibile.

Introduzione

Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) è stato ampiamente utilizzato come un sensore biometrico per rilevare piccole molecole quali zuccheri, ioni calcio e aminoacidi ^1-4. biosensori FRET contengono proteine ​​fluorescenti, proteine ​​fluorescenti ciano (CFP), e le proteine ​​fluorescenti gialli (YFPs), che si fondono ad entrambe le estremità delle proteine ​​periplasmatiche-binding (PBP). Zuccheri legano ai PBP situati al centro del sensore FRET, provocando cambiamenti strutturali al sensore che successivamente alterare l'orientamento distanza e la transizione dipolo delle due proteine ​​fluorescenti alle estremità del PBP. Questa modifi....

Protocollo

1. Preparazione del biosensore

1. Costruire il plasmide pET21a (+) - CFP-MBP-YFP-His6 seguendo il protocollo precedentemente stabilito ^2.
2. Seminare 5 ml di Luria Broth (LB) con una singola colonia di un ceppo di Escherichia coli DE3 e incubare a 37 ° C per 16 ore con agitazione.
3. Trasferire 1 ml della / culture O N in un pallone da 500 ml contenente 100 ml LB ed incubare a 37 ° C in un incubatore agitando fino alla densità ottica a 600 nm (OD ₆₀₀₎ raggiunge 0,5 (circa 3 ore).
4. Raccogliere le cellule in una provetta conica da 50 ml per centrifugazione a 1000 g per 20 minuti a 4 ° C.
5. Risospende....

Risultati

Per eseguire l'analisi quantitativa del contenuto di zucchero usando l'analizzatore FRET, è necessario costruire una curva adattata stimare la concentrazione di zucchero destinazione dal rapporto FRET osservato. Sia r definisce il rapporto tra l'intensità di emissione di PCP a 480 nm e l'intensità di emissione di YFP generato a 530 nm (Eq. 1).

Discussione

Questo protocollo permette quantificazione rapida ed efficiente del tenore di zucchero nei campioni bevande, utilizzando un analizzatore di FRET misura ⁷ ad una temperatura ottimale per sensori FRET. L'analizzatore è stato progettato con un recentemente sviluppato, poco costoso banda 405-nm ultravioletta-LED come fonte di luce e due fotorivelatori con un fotodiodo al silicio. Questo dispositivo è più conveniente rispetto ad altri Fluorimetro comparabili. Il dispositivo ha mostrato alta sensibilità di rile.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
LB	BD	#244620
isopropilβ-D-tiogalattoside (IPTG)	Sigma	I6758
Ampicillina	Sigma	A9518
Tri-HCl	Bioneer	C-9006-1
PMSF	Sigma	78830
EDTA	Bioneer	C-9007
DTT	Sigma	D0632
NaCl	Junsei	19015-0350
soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Gibco	70011-044	0,8% NaCl, 0,02% KCl, 0,0144% Na2HPO4, 0,024% KH2OP4, pH 7,4
SOC			2% triptone, 0,5% estratto di lievito, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MGCl2, 20 mM Risorsa glucosio
Q	Amersham Biosciences	17-1177-01	6 &volte; 30 mm colonna per cromatografia a scambio anionico
HisTrap HP1	Amersham Biosciences	29-0510-21
Cuvetta al quarzo	Sigma	Z802875
AKÄ KTAFPLC	Amersham Biosciences	18-1900-26	una cromatografia liquida veloce delle proteine (FPLC)
Cary Eclipse	VarianInc		uno spettrofotometro a fluorescenza
VICTOR	PerkinElmer	2030-0050	a lettore di piastre multilabel
E. coli JM109 (DE3)	Promega		Electrocompetent cells
A (Beverage)	Korea Yakult Co. (Corea)Birak		Bevande fermentate
B (Bevande)	Lotte Foods (Corea)	Epro	Soft drink
C (Beverage)	Lotte Foods (Corea)	Getoray	Sports drink