Taşınabilir FRET Analyzer ile son derece hassas ve hızlı Floresan Algılama
Summary
Bu protokol, ısmarlama bir taşınabilir FRET analizörü kullanarak Förster rezonans enerji transferi (FRET) sensörü verilerinin hızlı ve son derece hassas ölçümü açıklanır. Cihaz şeker içeriğinin pratik ve etkili bir değerlendirme sağlayan saptama hassasiyetini maksimuma kritik sıcaklık aralığında maltoz tespit etmek için kullanıldı.
Abstract
Förster rezonans enerji transferi son gelişmeler (FRET) sensörleri iyonların ve amino asitler gibi çeşitli küçük moleküller tespit etmek kullanımını sağlamıştır. Ancak, FRET sensörlerinin doğuştan zayıf sinyal yoğunluğu çeşitli alanlarda uygulamalarını engeller ve pahalı, high-end kullanılması gerekli Fluorometreler yapan önemli bir sorundur. Daha önce, özellikle yüksek algılama hassasiyetini elde etmek için iki emisyon dalga boyu bantları (530 ve 480 nm) oranını ölçebilen bir maliyet-etkin, yüksek performanslı FRET analizörü inşa. 55 ° C – Daha yakın zamanda, bakteriyel periplazmik bağlayıcı proteinleri ile FRET sensörler 50 kritik sıcaklık aralığında en yüksek hassasiyete sahip ligandlar tespit keşfedilmiştir. Bu rapor, bir ısı özgü FRET sensörü ile portatif FRET analizörü kullanılarak ticari olarak temin edilebilen içecek numuneleri şeker içeriği değerlendirmek için bir protokol açıklamaktadır. Bizim sonuçlar ek ön ısıtma gösterdiFRET sensörünün süreci önemli ölçüde şeker içeriği daha doğru ölçüm sağlamak için, FRET oranı sinyalini artırır. ısmarlama FRET analizörü ve sensör başarıyla ticari içecek üç tip şeker içeriği ölçmek için uygulanmıştır. Biz high-end ekipman mevcut olmadığı durumlarda ekipman daha fazla boyut küçültme ve performans geliştirme ortamlarında el analiz kullanımını kolaylaştırmak olacağını tahmin ediyoruz.
Introduction
Förster rezonans enerji transferi (FRET), yaygın olarak, şekerler, kalsiyum iyonları, ve amino asitler 1-4 küçük moleküllerin tespit biyometrik sensör olarak kullanılmıştır. FRET biyosensörler floresan proteinleri, mavi floresan proteinleri (Çağrıları) ve periplazmik-bağlayıcı proteinlere (PBP) her iki ucuna kaynaştırılır san bir floresan proteinleri (YFPs), ihtiva etmektedir. Şekerler daha sonra PBP her iki ucunda iki floresan protein mesafesi ve geçiş dipol yönünü değiştirme sensörüne yapısal değişikliklere neden FRET sensörü ortasında bulunan PBP bağlanır. Bu değişiklik, EYFP (530 nm) ve ECFP (480 nm) emisyon dalga boyları oranını ölçerek şeker içeriğinin nicel analiz edilmesini sağlar. Yüksek hassasiyet, seçicilik, gerçek zamanlı izleme kapasitesi ve FRET biyosensörlerin hızlı tepki süresi sayesinde, bu sensörler yaygın çevresel, endüstriyel ve tıbbi uygulamalarda 5 kullanılmaktadır. Ayrıca, ratiomSensör konsantrasyonu kolaylıkla kontrol edilebilir ve eşiğe her zaman mevcut olamaz kompleks biyolojik örneklerinde bileşenleri ölçmek için kullanılabilir gibi FRET biyosensörler kullanılarak Etric ölçümü, önemli pratik avantajları vardır.
nicel görselleştirme için FRET tabanlı sensörlerin bu avantajlara rağmen, floresan proteinleri eksik alan hareket transferi ile küçük yapısal değişiklikler doğal olarak zayıf sinyal yoğunluğu üretir. Bu zayıf sinyal in vitro ya da in vivo analiz 6'da FRET bazlı sensörler uygulanmasını sınırlar. Sonuç olarak, çoğu biyosensörler pahalı ve son derece hassas ekipmanların kullanılmasını gerektirir FRET. Daha önce, mevcut flüoresan analiz 7 benzer yetenekleri ile ucuz ve taşınabilir bir FRET analizörü geliştirdi. Bu cihaz, ucuz 405-nm bant ultraviyole ışık yayan diyot (LED) olarak th uyarma neden ışık kaynağı olarak kullanıldıe floresan sinyali, pahalı bir lamba veya lazer değiştirilmesi. analizörü algılama sistemi verimli bir silikon fotodiyot iki fotodedektörlerle üzerine dissipating floresan sinyali odaklanır. 55 ° C belirgin oranlı metrik FRET sinyalini 8 büyütmek olabilir – daha yeni bir çalışmada, 50 tespit sıcaklığının optimizasyonu olduğunu göstermiştir. Bu sıcaklık-spesifik sinyal geliştirme, ısmarlama FRET analizörü ile birlikte hızlı ve yüksek hassasiyet ile daha genel tanısal uygulamalarda FRET sensörlerinin kullanılmasını sağlar.
Bu protokol, biz ticari olarak temin edilebilen içeceklerin şeker içeriğinin miktarının optimal FRET sıcaklık koşulları altında FRET analizörü genel uygulanabilirliği gösterdi. Bu protokol FRET cihaz operasyonun ayrıntıları yanı sıra, sensörlü ve numune hazırlama kısa bir açıklamasını sağlar. Bu raporun taşınabilir potansiyel uygulanmasını teşvik edeceğini tahminküçük ölçekli laboratuvar ortamlarında analiz ve FRET tabanlı biyosensörler ile ucuz bünyesinde tanı cihazı daha da geliştirilmesi için bir temel oluşturacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol FRET sensörler için optimal bir ısıda bir ısmarlama FRET analizörü 7 kullanarak, içecek örneklerinde şeker içeriğinin hızlı ve etkili bir ölçümü sağlar. analizörü yakın zamanda geliştirilen, ucuz 405-nm bant ışık kaynağı ve bir silikon fotodiyot iki fotodedektörlerle olarak ultraviyole-LED ile tasarlanmıştır. Bu cihaz, daha düşük maliyetli, diğer benzer Fluorometreler daha uzundur. FRET sensörler için en uygun sıcaklık aralığında iki emisyon dalga boyu ba…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma Küresel Frontier Projesi (2011-0031944) ve KRIBB Araştırma Girişimi Programı Akıllı Sentetik Biyoloji Merkezi'nden hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| LB | BD | #244620 | |
| isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) | Sigma | I6758 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Tri-HCl | Bioneer | C-9006-1 | |
| PMSF | Sigma | 78830 | |
| EDTA | Bioneer | C-9007 | |
| DTT | Sigma | D0632 | |
| NaCl | Junsei | 19015-0350 | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4 |
| SOC | 2% tryptone, 0.5% Yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MGCl2, 20 mM Glucose | ||
| Resource Q | Amersham Biosciences | 17-1177-01 | 6 × 30 mm anion-exchange chromatography column |
| HisTrap HP1 | Amersham Biosciences | 29-0510-21 | |
| Quartz cuvette | Sigma | Z802875 | |
| AKÄKTAFPLC | Amersham Biosciences | 18-1900-26 | a fast protein liquid chromatography (FPLC) |
| Cary Eclipse | VarianInc | a fluorescence spectrophotometer | |
| VICTOR | PerkinElmer | 2030-0050 | a multilabel plate reader |
| E. coli JM109 (DE3) | Promega | Electrocompetent cells | |
| A (Beverage) | Korea Yakult Co. (Korea) | Birak | Fermented drinks |
| B (Beverage) | Lotte Foods (Korea) | Epro | Soft drink |
| C (Beverage) | Lotte Foods (Korea) | Getoray | Sports drink |
Riferimenti
- Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering. Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).
- Ha, J. S., Song, J. J., Lee, Y. M., Kim, S. J., Sohn, J. H., Shin, C. S., Lee, S. G. Design and application of highly responsive fluorescence resonance energy transfer biosensors for detection of sugar in living Saccharomyces cerevisiae cells. Appl. Environ. Microbiol. 73 (22), 7408-7414 (2007).
- Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (29), 10554-10559 (2004).
- Okumoto, S., Looger, L. L., Micheva, K. D., Reimer, R. J., Smith, S. J., Frommer, W. B. Detection of glutamate release from neurons by genetically encoded surface-displayed FRET nanosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (24), 8740-8745 (2005).
- Merzlyakov, M., Li, E., Casas, R., Hristova, K. Spectral Förster resonance energy transfer detection of protein interactions in surface-supported bilayers. Langmuir. 22 (16), 6986-6992 (2006).
- Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).
- Kim, H., Kim, H. S., Ha, J. S., Lee, S. G. A portable FRET analyzer for rapid detection of sugar content. Analyst. 140 (10), 3384-3389 (2015).
- Gam, J., Ha, J. -. S., Kim, H., Lee, D. -. H., Lee, J., Lee, S. -. G. Ratiometric analyses at critical temperatures can magnify the signal intensity of FRET-based sugar sensors with periplasmic binding proteins. Biosens. Bioelectron. 72, 37-43 (2015).
- Hessels, A. M., Merkx, M. Genetically-encoded FRET-based sensors for monitoring Zn2+ in living cells. Metallomics. 7 (2), 258-266 (2015).
- Song, Y., Yang, M., Wegner, S. V., Zhao, J., Zhu, R., Wu, Y., He, C., Chen, P. R. A genetically encoded FRET sensor for intracellular heme. ACS Chem. Biol. 10 (7), 1610-1615 (2015).
- . Fluorescent Protein Guide: Biosensors Available from: https://www.addgene.org/fluorescent-proteins/biosensors/ (2015)
- Rajendran, R., Rayman, G. Point-of-care blood glucose testing for diabetes care in hospitalized patients: an evidence-based review. J. Diabetes Sci. Technol. 8 (6), 1081-1090 (2014).
- Vyas, N. K., Vyas, M. N., Quiocho, F. A. Sugar and signal-transducer binding sites of the Escherichia coli galactose chemoreceptor protein. Science. 242, 1290-1295 (1988).
- Leermakers, E. T. M., Felix, J. F., Erler, N. S., Ċerimagić, A., Wijtzes, A. I., Hofman, A., Raat, H., Moll, H. A., Rivadeneira, F., Jaddoe, V. W., Franco, O. H., Kiefte-de Jong, J. C. Sugar-containing beverage intake in toddlers and body composition up to age 6 years: The Generation R Study. Eur. J. Clin. Nutr. 69 (3), 314-321 (2015).
- Shilts, M., Styne, D., Drake, C., Aden, C., Townsend, M. Fast food, fat and sugar sweetened beverage items are related to children’s dietary energy density. FASEB J. 29 (1), 731-736 (2015).
- Larsson, S. C., Åkesson, A., Wolk, A. Sweetened beverage consumption is associated with increased risk of stroke in women and men. J Nutr. 144 (6), 856-860 (2014).
- Melkko, S., Neri, D., Vaillancourt, P. E. Calmodulin as an affinity purification tag. E. coli Gene Expression Protocols. , 69-77 (2003).
