Svært Sensitive og Rapid Fluorescence Detection med en bærbar FRET Analyzer

Summary

Denne protokollen beskriver den raske og svært sensitive kvantifisering av Förster resonans energi overføring (FRET) sensordata ved hjelp av en skreddersydd bærbar FRET analysator. Anordningen ble benyttet for å detektere maltose innenfor et kritisk temperaturområde som maksimerer følsomhet, slik at praktisk og effektiv vurdering av sukkerinnhold.

Abstract

Nylige forbedringer i Förster resonans energi overføring (FRET) sensorer har aktivert deres bruk for å påvise ulike små molekyler inkludert ioner og aminosyrer. Imidlertid er medfødt svak signalintensiteten av FRET sensorer en stor utfordring som hindrer deres anvendelse på forskjellige områder, og gjør bruken av dyre, high-end fluorometers nødvendig. Tidligere har vi en kostnadseffektiv, høy ytelse FRET analysator som spesifikt måle forholdet mellom to bølgelengdebånd utslipp (530 og 480 nm) for å oppnå høy følsomhet. Mer nylig ble det oppdaget at FRET sensorer med bakteriell periplasmatiske bindingsproteiner påvise ligander med maksimal følsomhet i det kritiske temperaturområde på 50 – 55 ° C. Denne rapporten beskriver en protokoll for vurdering av sukkerinnhold i kommersielt tilgjengelige drikke prøver å bruke våre bærbare FRET analysator med en temperatur-spesifikk FRET sensor. Våre resultater viste at den ytterligere forvarmingFremgangsmåten ifølge fore FRET sensoren øker betydelig FRET forholdet signal, for å muliggjøre mer nøyaktig måling av sukkerinnhold. Den skreddersydde FRET analysator og sensor ble vellykket anvendt for å kvantifisere sukkerinnholdet i tre typer kommersielle drikker. Vi forventer at ytterligere størrelsesreduksjon og ytelse forbedring av utstyret vil forenkle bruken av håndholdte analysatorer i miljøer hvor high-end utstyr er ikke tilgjengelig.

Introduction

Förster resonans energioverføring (FRET) har blitt mye brukt som en biometrisk sensor for å detektere små molekyler slik som sukkere, kalsiumioner, og aminosyrer ^1-4. FRET biosensorer inneholder fluorescerende proteiner, cyan fluorescerende proteiner (CFPS) og gul fluorescerende proteiner (YFPs), som er kondensert til begge ender av periplasmatiske bindende proteiner (PBP). Sukker binde til PBP som befinner seg i midten av FRET sensoren, forårsaker strukturelle endringer i den sensor som senere forandre avstanden og overgangen dipol orientering av de to fluorescerende proteiner ved hver ende av PBP. Denne endringen muliggjør kvantitativ analyse av sukkerinnhold ved å måle forholdet mellom emisjonsbølgelengder av EYFP (530 nm) og ECFP (480 nm). På grunn av den høye følsomheten, spesifisitet, sanntids overvåking kapasitet og rask responstid på FRET biosensorer, er disse sensorene mye brukt i miljømessige, industrielle og medisinske applikasjoner ^5. Videre ratiomferometrisk måling ved hjelp av FRET biosensorer har viktige praktiske fordeler, ettersom den kan brukes til å måle komponenter i komplekse biologiske prøver hvor sensoren konsentrasjonen ikke lett kan kontrolleres og bakgrunnsfluorescens alltid er til stede.

Til tross for disse fordeler med FRET-baserte sensorer for kvantitativ visualisering, små strukturelle endringer med ufullstendig domene bevegelsesoverføring til de fluorescerende proteiner frembringe iboende svake signalintensitet. Det svake signalet begrenser anvendelsen av FRET-baserte sensorer for in vitro eller in vivo analyse ^6. Følgelig har de fleste FRET biosensorer krever bruk av dyre og svært sensitivt utstyr. Vi har tidligere utviklet en rimelig og portabel FRET analysator med kapasiteter som ligner på de eksisterende fluorescens-analyse ^7. I denne anordning, billig 405-nm bånd ultrafiolett lys-emitterende diode (LED) ble anvendt som lyskilde for å forårsake eksitasjon av the fluorescens signal, og erstatte en dyr lampe eller laser. Deteksjonssystemet på analysatoren fokuserer effektivt dissipating fluorescens signal på to photodetectors med en silisiumfotodiode. I en nyere studie viste vi at optimalisering av deteksjon temperatur på 50 – 55 ° C kunne gi en betydelig foredle proporsjonal FRET signal ^åtte. Denne temperaturen spesifikt signal forsterkning, sammen med skreddersydde FRET analysator, muliggjør bruk av FRET sensorer i mer generelle diagnostiske applikasjoner med rask og høy følsomhet.

I denne protokollen, demonstrerte vi den generelle anvendelighet av den FRET analysatoren under optimale FRET temperaturbetingelser ved å kvantifisere sukkerinnholdet i kommersielt tilgjengelige drikkevarer. Denne protokollen gir detaljene FRET anordning drift, samt en kort beskrivelse av sensor og prøvepreparering. Vi forventer at denne rapporten vil fremme potensialet anvendelsen av den bærbareanalysator i småskala laboratoriemiljøer og gi et grunnlag for videre utvikling av et billig på stedet diagnostisk enhet med FRET-baserte biosensorer.

Protocol

1. Utarbeidelse av Biosensor Konstruere plasmidet pET21a (+) – CFP-MBP-YFP-His6 ved å følge den tidligere etablerte protokoll 2. Inokulere 5 ml Luria-buljong (LB) med en enkelt koloni fra en Escherichia coli-stamme DE3 og inkuber ved 37 ° C i 16 timer med risting. Overføre 1 ml av O / N kultur til en 500 ml kolbe inneholdende 100 ml LB og inkuber ved 37 ° C i en risteinkubator inntil den optiske tettheten ved 600 nm (OD 600) når 0,5 (ca. 3 timer). …

Representative Results

For å utføre kvantitativ analyse av sukkerinnhold ved bruk av FRET analysator, er det nødvendig å bygge en montert kurve estimere mål sukkerkonsentrasjonen fra den observerte FRET-forhold. La r definere forholdet mellom utslipps intensiteten av CFP ved 480 nm og emisjonsintensiteten YFP genereres ved 530 nm (Eq. 1). <p class="jove_content"…

Discussion

Denne protokollen tillater rask og effektiv kvantifisering av sukkerinnholdet i drikkeprøver, ved hjelp av en skreddersydd FRET analysator ⁷ på en optimal temperatur for FRET sensorer. Analysatoren er designet med en nyutviklet, billig 405-nm bandet ultrafiolett-LED som lyskilde og to photodetectors med en silisiumfotodiode. Denne enheten er mer kostnadseffektivt enn andre sammenlign fluorometers. Innretningen viste høy følsomhet, spesielt ved måling av forholdet mellom to bølgelengdebånd utslipps (530…

Materials

LB	BD	#244620
isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG)	Sigma	I6758
Ampicillin	Sigma	A9518
Tri-HCl	Bioneer	C-9006-1
PMSF	Sigma	78830
EDTA	Bioneer	C-9007
DTT	Sigma	D0632
NaCl	Junsei	19015-0350
phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	70011-044	0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4
SOC			2% tryptone, 0.5% Yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MGCl2, 20 mM Glucose
Resource Q	Amersham Biosciences	17-1177-01	6 × 30 mm anion-exchange chromatography column
HisTrap HP1	Amersham Biosciences	29-0510-21
Quartz cuvette	Sigma	Z802875
AKÄKTAFPLC	Amersham Biosciences	18-1900-26	a fast protein liquid chromatography (FPLC)
Cary Eclipse	VarianInc		a fluorescence spectrophotometer
VICTOR	PerkinElmer	2030-0050	a multilabel plate reader
E. coli JM109 (DE3)	Promega		Electrocompetent cells
A (Beverage)	Korea Yakult Co. (Korea)	Birak	Fermented drinks
B (Beverage)	Lotte Foods (Korea)	Epro	Soft drink
C (Beverage)	Lotte Foods (Korea)	Getoray	Sports drink