للدم الجذعية والسلف الخلايا (HSPC) مستمدة من المتخصصة (مكون للدم) الخلايا البطانية خلال تطوير، ولكن لا يعرف الكثير عن العملية التي بعض الخلايا البطانية تحدد لتصبح تكوين الدم. ونحن لشرح طريقة التدفق الخلوي على أساس السماح العزلة في وقت واحد من الخلايا البطانية مكون للدم وHSPC من الأنسجة الجنينية في الفئران.
وتحدث هذه المواصفات من الخلايا البطانية مكون للدم من بطانة الأوعية الدموية الجنينية أثناء فترات النمو وجيزة داخل أنسجة متميزة، وضرورية لظهور نهائية HSPC من الفئران اضافية الكيس الجنيني صفار البيض، والمشيمة، والأوعية السري، والجنينية الشريان الأورطي، الغدد التناسلية-mesonephros ( إجتماع الجمعية العامة العادية) المنطقة. يجعل طبيعة عابرة وصغر حجم هذه الفئة من السكان زنزانة انفرادية استنساخه من أجل تقدير دقيق والتطبيقات التجريبية من الصعب من الناحية الفنية. أنشأنا مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS) بروتوكول المستندة لعزل في وقت واحد من الخلايا البطانية مكون للدم وHSPC خلال أوقات الذروة جيل في الكيس المحي والجمعية العمومية. ونحن لشرح طرق للتشريح من الكيس المحي والأنسجة AGM من أجنة الفئران، ونحن تقديم الأمثل الهضم الأنسجة وتصريف الأجسام المضادة شروط بقاء الخلية القصوى قبل تحديد واسترجاع عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية. ممثل FACS آناوترد المؤامرات تحلل التي تحدد الخلية البطانية مكون للدم والظواهر HSPC، ووصف مقايسة على أساس ميثيل لتقييم دمائهم تشكيل إمكانيات على مستوى نسيلي.
يتطلب نظام الدورة الدموية وظيفية لتطور مواز للأوعية الدموية وخلايا الدم. في المراحل الأولى من تطوير الدم (تكون الدم بدائية)، وأصل الأرومة الحمراء لا تزال ناقش بقوة 1. في المقابل، في مراحل لاحقة من تطوير خلايا الدم (تكون الدم نهائيا)، فقد أصبح من الواضح بشكل متزايد أن تعدد النسب HSPC تنشأ من الخلايا المتخصصة الأوعية الدموية البطانية التي تحصل على الدم تشكيل المحتملة (الخلايا البطانية مكون للدم) داخل الكيس المحي، المشيمة، واجتماع الجمعية العامة العادية 2-5، وكذلك في المحي والأوعية السري، البطانة الجنينية 6، ورئيس الأوعية الدموية 7. مواصفات من الخلايا البطانية مكون للدم داخل هذه الأنسجة متميزة تحدث في مراحل معينة من التنمية؛ على سبيل المثال، داخل الكيس المحي في ~ E8.25 وفي اجتماع الجمعية العمومية في ~ E10 8-12. ومع ذلك، وحتى خلال هذه النوافذ التنموية محددة، فإن عدد سكان إندو مكون للدمخلايا thelial تمثل جزء صغير من جميع الخلايا البطانية (1-3٪ من الكيس المحي والخلايا البطانية إجتماع الجمعية العامة العادية) 11،12. عملية مكون للدم خلية "مواصفات" البطانية هو أمر حاسم لالفئران، وكذلك الإنسان، تكون الدم. وقد ثبت أن الخلايا المكونة للدم لبرعم من البطانة من السفن الكيس المحي والشريان الأورطي في الأجنة البشرية 13، ولقد أظهرت العديد من المختبرات أن إنتاج خلايا الدم من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان يتطلب خلية البطانية المتوسطة 14-16. وهكذا، وتحديد النمط الظاهري الخلايا البطانية مكون للدم الفئران وفهم الأحداث الجزيئية التي تؤدي إلى تطوير في هذا النموذج الحيواني ينبغي أن تيسر السعي من التقنيات في المختبر لتوليد الخلايا البطانية مكون للدم من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان. بدوره، التنمية في نهاية المطاف من نهج لتوليد نطاق واسع من أنواع خلايا الدم متباينة من HSPC متعددة النسب – أنفسهم درعيفيد من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان عن طريق الخلايا البطانية مكون للدم ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية وسيطة – سيكون لها الإمكانات العلاجية المذهلة لالدموية، علم الأورام والطب التجديدي. وتحقيقا لهذا الهدف، قمنا بتحديد النمط الظاهري الخلايا البطانية مكون للدم، على مستوى نسيلي، للصفار داخل الفئران كيس 11 و AGM 12، واثنين من المواقع الرئيسية لإنتاج HSPC نهائي خلال مرحلة التطور الجنيني. مثل HSPC ضمن الكبار نخاع العظم 17، والخلايا البطانية مكون للدم الجنينية وHSPC معرض هويشت خصائص صبغ هروب رأس المال، وبالتالي تظهر ضمن "سكان الجانب" (SP) من الخلايا في مؤامرة FACS 5،11،12 (كما هو موضح في الشكل 3). وبالإضافة إلى ذلك، لقد أظهرنا أيضا أن الخلايا البطانية مكون للدم تعبر عن علامات على حد سواء البطانية والخلايا الجذعية (Flk1 وcKit، على التوالي)، ولكن لا تعبر عن علامة النسب المكونة للدم، CD45 5،11،12. وهكذا، يمكن أن الخلايا البطانية مكون للدم أن يكون الرمزكخلايا Flk1 + / + cKit / CD45- ليرة سورية، وأظهرنا ified ومعزولة من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية أن هذه الخلايا تفرز HSPC الواردة في / cKit + / CD45 + SP جزء Flk1- من الكيس المحي والخلايا اجتماع الجمعية العامة العادية 5،11،12. الخلايا البطانية مكون للدم وHSPC يمكن تحديد وعزل من الكيس المحي أو الأنسجة إجتماع الجمعية العامة العادية حصادها إما من الأجنة الموت الرحيم حديثا، أو من أجنة مثقف لمدة تصل إلى 48 ساعة في فيفو السابقين الثقافة الجنين (كما هو مبين في الشكل 1). وتسمح خارج الحي ثقافة انتقائية المعالجة المسبقة للأجنة الفردية مع وكلاء الدوائية، ويسمح أيضا للتعبير عابر الجينات المحورة المطلوب (أي من قبل تنبيغ lentiviral). تحديد نظام مراقبة الأصول الميدانية من الخلايا البطانية مكون للدم وHSPC بالطريقة الموصوفة هنا يمكن أن تستخدم مقياس كمي للتنمية المكونة للدم نهائية في نماذج الماوس التلاعب بها وراثيا. ويمكن أيضا أن الخلايا يمكن استرجاعها لتطبيقات تجريبية لاحقة، بما في ذلك الدم فوالمقايسات rming، تحليل التعبير، والزرع.
الموضوعات الحيوان: الاستخدامات والاعتبارات الأخلاقية
وقد أنشأت مجموعة متزايدة من الأدب مساهمة مهمة من الخلايا البطانية مكون للدم لتشكيل HSPC خلال المرحلة تكون الدم نهائية من التطور الجنيني. ومع ذلك، فإن الظروف والإشارات الفيزيولوجية التي تعزز مواصفات جزء من السكان من الخلايا البطانية نحو مصير دموي المنشأ لا تزال غير مفهومة تماما، وبالتالي لا يمكن حتى الآن تحاكي في الإعداد في المختبر. في الواقع، التقنيات الموضحة في هذه الورقة هي حاليا قيد الاستخدام من قبل مختبرنا وجماعات أخرى لتحسين الفهم للحقل التنمية hematovascular، بحيث نهجا لخارج الحي مواصفات الخلايا البطانية مكون للدم والإنتاج HSPC قد وضعت يوم واحد. حتى هذا الوقت، ومع ذلك، لا يزال هذا المجال يعتمد على الأنسجة الأولية من النوع البري (والجينتعديل tically) أجنة الفئران للحصول على تحديد الخلايا البطانية مكون للدم وHSPC لمزيد من الدراسة. الخلايا البطانية مكون للدم وHSPC يمكن التعرف بشكل صحيح وعزل من أي E8.5 (10-12 أزواج الجسيدة) الكيس المحي أو E10.5 (35 – 40 أزواج الجسيدة) إجتماع الجمعية العامة العادية 11،12. بسبب الندرة النسبية للخلايا البطانية مكون للدم (عادة ما يمثل 1-3٪ من مجموع الخلايا البطانية 11،12 داخل هذه الأنسجة) تجميع للأنسجة متعددة (~ 8-10) تتزاحم في عينة واحدة من المستحسن ل الحصول على خلايا كافية للتجريب لاحق. التحقق من أن الخلايا البطانية مكون للدم وHSPC وقد تم تحديد بنجاح وعزل ويمكن تحقيق ذلك عن طريق الثقافة من الخلايا التي تم استردادها في ظل الظروف التي تحفز المكونة للدم التمايز. في ظل هذه الظروف، فإن الخلايا البطانية مكون للدم وHSPC يحمل متعددة النسب المكونة للدم التمايز، مما أدى إلى ظهور المستعمرات التي تحتوي على ريهاالأسلاف throid (الاتحاد البلغاري-E)، محببة والبلاعم الأسلاف (كفو-GM)، ومحببة وكرات الدم الحمراء، بلعم، المستعمرات النواء السلف (كفو-GEMM).
لا تزال هناك الكثير من علامات الاستفهام في مجال التنمية hematovascular – حقل التي لا تزال في مهدها بسبب الصعوبات التقنية الكامنة في دراسة عابرة وعدد صغير من الخلايا التي تظهر فقط خلال نوافذ تنموية محددة. التقنيات المذكورة أعلاه وتخفف كثيرا من هذه الصعوبات من خلال السماح لعزل الخلايا حتى واحدة من الخلايا البطانية مكون للدم والسكان HSPC في الأنسجة الجنينية في نقطة زمنية التنموية الحرجة باستخدام الكواشف والمعدات المتوفرة في معظم المختبرات عادة. كما يسمح بروتوكول لدينا لعزل موازية من غير مكون للدم كسور الخلايا البطانية من YS واجتماع الجمعية العامة العادية، والتي يمكن استخدامها لتحليل مستقلة، أو ضوابط لمكون للدم جزء الخلايا البطانية في التحليلات اللاحقة.
وهناك نقطة رئيسية في عزل الخلايا البطانية مكون للدم باستخدام هذا الأسلوب متعدد الألوان المعتمدة على نظام مراقبة الأصول الميدانية هي شارك الطيفي المناسبmpensation والرسم الدقيق للبوابات أحادية اللون. على هذا النحو، فمن المستحسن أن يتم تضمين الضوابط غير ملوثين وأحادية اللون في جميع أشواط التجريبية، وأنها – جنبا إلى جنب مع عينات تعامل مع الأجسام المضادة ضبط مطابقة نمط إسوي – استخدامها لإنشاء مبدئيا تعويض الطيفي السليم ورسم البوابات. ومع ذلك، وتلطيخ غير محددة هو الحد الأدنى من هذا البروتوكول، وبالتالي التحكم غير ملوثين وأحادية اللون كافية للتحقق روتيني من البوابات مرة واحدة وقد تم تحسين إعدادات فارز FACS.
بوابات SP رسمها بشكل غير دقيق هو مصدر قلق خاص مع النهج المبينة في هذا التقرير. وقد أظهرت دراسات سابقة أن الخلايا الجذعية متعددة القدرات المعرض هروب رأس المال تفضيلية من هويشت الأحمر 17، والتي تشكل أساسا فسيولوجيا لظهورها في SP بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية. لقد أظهرنا أن الخلايا البطانية مكون للدم وHSPC توجد بالمثل في جزء الخلية SP 5،11. المخدرات مثل قناة الكالسيوم فيhibitor فيراباميل منع هذا السلوك هويشت صبغ هروب رأس المال في الخلايا SP عبر انسداد مجموعة متنوعة من النقل عبر الغشاء المقاومة للأدوية المتعددة. في الخلايا الجذعية المكونة للدم والسلف، ويحدث هذا في المقام الأول عن طريق نقل ABCG2 / BCRP1 24. وعادة ما يؤدي الى فيراباميل> 50٪ انسداد ليرة سورية، ومع ذلك، فقد أظهرت الدرجة الكلية للهويشت هروب رأس المال وانسداد لاحقا من قبل فيراباميل يرى أن تتأثر توقيت التنموي، ويفترض بسبب تغير تعبير عن أدوية المتعددة متعددة الأنواع نقل المقاومة مع الفارق هويشت القدرة هروب رأس المال، والحساسية للفيراباميل 5. وبالتالي، فمن المستحسن أن فيراباميل المعالجة هويشت الملطخة سلبية السيطرة إدراجها standardly لضمان النابضة SP الصحيح: إذا ويوجه بوابة SP بشكل صحيح، يجب أن يتم الكشف عن انخفاض ملحوظ في عدد الخلايا SP في عينات ملطخة هويشت في وجود فيراباميل.
لقد أظهرنا في وقت سابق ان فرزخلايا ليرة سورية من الكيس E9.5 الفئران صفار لها ~ 80-90 أضعاف قدرة أكبر على توليد HSPC في الثقافة المكونة للدم القائم على ميثيل بالمقارنة مع عدد متطابق من E9.5 غير المجزأ، الملطخة غير هويشت-كلها خلايا الأنسجة YS 5. وقد أظهرت المزيد من توصيف ليرة سورية أنه في الكيس المحي الفئران خلال المكونة للدم في وقت مبكر والتنمية الأوعية الدموية في E8.0، هناك تعبير ملموس من VE كادهيرين وFLK-1، ولكن انخفاض التعبير الجذعية (ج كيت) وعلامات المكونة للدم (CD45). وهكذا، في هذا timepoint التنموي، الأساسي (غير مكون للدم) EC، الذي يعرف بأنه FLK-1 + / CD31 + / CD45- خلايا غير SP تسود. هذا الملف التعبير التحولات كما يقلل التعبير علامة البطانية وCD45 وج كيت زيادات التعبير، بالتزامن مع القدرة المتزايدة لتوليد HSPC في المختبر بين E9.5 وE11.5 5. وهذا يشير إلى ويرد النشاط للدم من الأنسجة YS داخل SP، لتصبح أكثر وضوحا بين E9.5 وE11.5، وoccurrجي من خلال خسارة في الوقت المناسب من الخصائص البطانية والاستحواذ التدريجي للقدرة للدم. على هذا النحو، تعبيرا عن نقل المقاومة للأدوية المتعددة التي تؤدي إلى النمط الظاهري ليرة سورية وعلامة المظهرية الهامة من البطانة مكون للدم 5؛ في الواقع، خلايا غير SP-من اجتماع الجمعية العامة العادية لا يحمل المحتملين 12 المكونة للدم. وهكذا، العزلة الناجحة ليرة سورية عن طريق تلطيخ هويشت في كل من يس وAGM يضمن أن الخلايا ستحفظ من حجرة للدم الخلايا الجذعية من نسيج معين، ولاحق تلوين الأجسام المضادة للخلايا داخل هذا الجزء سوف تسمح التمييز من مكون للدم (FLK -1 + / ج كيت + / CD45-) مقابل HSPC (Flk1- / ج طقم + / CD45 +) السكان 5،11،12. وعلاوة على ذلك، فقد كان سابقا لاحظت أن CD41 + الخلايا داخل SP من الكيس المحي والأنسجة اجتماع الجمعية العامة العادية قادرة على تشكيل مستعمرة متعددة النسب في ميثيل ثقافة تقوم 11،12. نحدد الخلايا البطانية مكون للدم كما Flk1 + ج كيت + خلية CD45- SPالصورة باستخدام CD45 كعلامة المعينة من النسب المكونة للدم وليس CD41 نظرا لدينا العثور على هذا التعبير من Flk1 وCD45 يكاد يستبعد بعضها بعضا 5،11. هذا يسمح للعزلة نقية من الخلايا داخل SP أن يكون كل من البطانية (FLK-1) ووقف الخصائص (ج كيت) اللازمة لالبطانية إلى الانتقال للدم ولكن التي لم تخضع بعد هذا التغيير، على النحو الذي يحدده غياب CD45 في هذه الخلايا. سيكون من المفيد النظر في تجزئة الفرعية من السكان HSPC، الذي يعرف باسم خلايا FLK-1- / ج كيت + / CD45 + / ليرة سورية، في Csf1r + (بلعم الأنسجة) وCsf1r- (شهادة الثانوية العامة) جزء كما ذكرت مؤخرا جوميز والزملاء 25، وهذا من شأنه أن يوفر دقة أكبر من HSPC الحقيقية مقابل السكان بلعم الأنسجة السلف، ولكن هذا لا ينبغي أن تؤثر على سلامة مكون للدم جزء الخلايا البطانية التي ذكرناها منذ Csf1r العزلة هو علامة من الأسلاف بلعم 26.
Hemogشبكة naric الخلايا البطانية هي جزء من السكان نادر في كل من يس واجتماع الجمعية العامة العادية (التي تضم 1-3٪ من الخلايا البطانية)، وبالتالي يشكل تحديا كبيرا في دراستهم غير كاف العائد خلية للتطبيقات اللاحقة. هذا البروتوكول النتائج عادة في 70-80٪ من الخلايا المتبقية قابلة للتطبيق في الوقت الفرز، ومكون للدم نوع الخلايا البطانية نموذجية من الأنسجة المجمعة تم الحصول عليها من الأجنة المتعددة قد تسفر سوى بضع مئات من الخلايا حتى في ظل الظروف المثلى مع فقط 10-20٪ من استرداد خلايا جزءا لا يتجزأ في إنتاج ميثيل المستعمرات. لتحقيق أقصى قدر من عدد الخلايا التي تم فرزها، فمن المستحسن أن المحققين تتخذ خطوات لضمان الأنسجة وبقاء الخلية في جميع أنحاء كل خطوة من خطوات الإجراء: الأنسجة يجب أن تشريح بسرعة وتجميع، ويجب أن تبقى عينات على الجليد كلما أمكن ذلك. وينبغي إعداد العينات الطازجة مباشرة قبل FACS الفرز، وفرزها في أنابيب جمع تحتوي على محتوى الدم المرتفع، أو مباشرة إلى ثقافة ميثيل وصفهد أعلاه. إذا استمرت المشاكل جدوى، أنابيب جمع ويمكن أيضا أن يكون ما قبل المغلفة مع المصل لتعزيز بقاء الخلية فرزها. إذا يبقى مكون للدم العائد الخلايا البطانية منخفضة، ونخاع العظام الكبار أو الخرز fluorophore مترافق المتاحة تجاريا يمكن أن تستخدم لتعويض الطيفي بدلا من الضوابط لون واحد المشتقة من الأنسجة الجنينية الموصوفة هنا. فإذا ما كان القصد خلايا فرز للثقافة، يجب أن يتم فرز الخلايا البطانية مكون للدم وHSPC مباشرة في الآبار زراعة الأنسجة. فإذا ما كان القصد خلايا فرز الحمض النووي أو تحليل التعبير الجيني المتعلقة RNA، والخلايا البطانية مكون للدم وغير مكون للدم وHSPC قد يتم فرزها مباشرة إلى أنابيب جمع تحتوي على عينة العازلة تحلل للحد من فقدان الخلية.
وتسمح هذه التقنية المبينة العزلة الناجحة (وفي وقت واحد) من الخلايا البطانية مكون للدم وغير مكون للدم، وكذلك HSPC وخلايا الدم الناضجة كسور من نفس الأنسجة الجنينية. هذا النهج يتيح مزيدا من عشيقذ من الأسس الجزيئية للالتحولات الهامة التي تحدث في الخلايا البطانية تولد الدم. ويمكن بعد ذلك الخبرات المكتسبة من هذه الدراسات التنموية أن تستخدم لتحسين توليد الخلايا البطانية مكون للدم الإنسان وHSPC ذرية من المحفزة، ويحتمل أن تكون ذاتي، الخلايا الجذعية لعلاج اضطرابات المكونة للدم السائدة.
The authors have nothing to disclose.
الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
DAPT (N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester) | Sigma | D5942 | TOXIC irritant: Wear eye protection, mask, and gloves when handling. |
Absorbent bench underpad | Covidien | 7134 | |
#5 Straight Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
8.5cm straight scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
Isoflurane (Isothesia) | Henry Schein | 50033 | TOXIC inhalant: Use in fume hood. |
100x Penicillin Streptomycin Glutamine (10,000u/mL Penicillin, 10,000mg/mL Streptomycin, 29.2mg/mL L-glutamine) | Invitrogen | 10378016 | |
Type II Collagenase | Worthington | LS004174 | |
Falcon 70uM nylon cell strainer | Corning | CLS431751 | |
Anti-Mouse CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-81 | |
Anti-Mouse CD31 – PE | eBioscience | 12-0311-81 | |
Anti-Mouse Flk-1 PE-Cy7 | BD Pharmingen | 561259 | |
Hoechst 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride) | Sigma | 14533 | TOXIC: irritant. Wear eye protection and gloves when handling. Prepare stock solution of 25mg/mL in distilled H2O, store aliquots at -20C until ready for use |
Verapamil Hydrochloride | Sigma | 1711202 | TOXIC: irritant. Wear eye protection, mask, and gloves when handling. Prepare stock solution of 5mM (100X) in 95% ethanol. Store at -20C until ready for use |
Falcon 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
MethoCult GF M3434 | Stem Cell Technologies | 3434 | Thaw and aliquot per manufacturer's instructions |
Modified Giemsa Stain | Sigma | GS500 | TOXIC: Contains Methanol – use in fume hood and wear gloves with handling. Dilute in distilled water to 0.02% solution. |
Cytospin Centrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | |
Clipped Funnel Starter Kit | Thermo Scientific | 3120110 | Includes cytofunnels, filter paper, cytoslides, and cytoclips for use with Cytospin centrifuge |
Anti-Mouse B-220 – FITC | BD Pharmingen | 553088 | |
Anti-Mouse Gr-1-FITC | eBioscience | 11-5931-85 | |
Anti-Mouse Ter-119-FITC | eBioscience | 11-5921-85 | |
Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | 10437-077 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (4.5g/L) | Life Technologies | 11965-092 | |
Hank's Buffered Salt Solution | Life Technologies | 14175-095 | |
Fibronectin-coated 24-well tissue culture plate | EMD Millipore | PIFB24P05 | |
IgG2A-PE | BD Pharmingen | 553930 | |
IgG2B-FITC | BD Pharmingen | 556923 |