الميوسين الاغاروز جل الكهربائي: ويسترن التنشيف للبروتينات سكرية عالية الوزن الجزيئي
Summary
Mucins are high-molecular-weight glycoconjugates, with size ranging from 0.2 to 200 megadalton (MDa). As a result of their size, mucins do not penetrate conventional polyacrylamide gels and require larger pores for separation. We provide a detailed protocol for mucin agarose gel electrophoresis to assess relative quantification and study polymer assembly.
Abstract
Mucins، البروتينات بشكل كبير الغليكوزيلاتي بطانة الأسطح المخاطية، وقد تطورت باعتبارها عنصرا أساسيا للدفاع الفطرية عن طريق حماية البشرة ضد مسببات الأمراض الغازية. الدور الرئيسي لهذه الجزيئات هو تسهيل محاصرة الجسيمات والتخليص مع تعزيز تزييت من الغشاء المخاطي. خلال تخليق البروتين، mucins الخضوع الشديد O-بالغليكوزيل وmultimerization، مما يزيد بشكل كبير من كتلة وحجم هذه الجزيئات. هذه التعديلات بعد متعدية بالغة الأهمية بالنسبة لخصائص اللزجة من المخاط. ونتيجة لطبيعة الكيمياء الحيوية والبيولوجية الفيزيائية المعقدة لهذه الجزيئات، والعمل مع mucins يوفر العديد من التحديات التي لا يمكن التغلب عليها عن طريق أساليب تحليل البروتين التقليدية. على سبيل المثال، من ارتفاع الوزن الجزيئي يمنع الهجرة الكهربي عن طريق المواد الهلامية بولي أكريلاميد العادية وطبيعتها لزجة تسبب التصاق لأنابيب التجريبية. ومع ذلك، والتحقيق في دور mucins في الصحة(على سبيل المثال، الحفاظ على سلامة الغشاء المخاطي) ومرض (على سبيل المثال، hyperconcentration، mucostasis، السرطان) ويجري التحقيق اكتسبت في الآونة الأخيرة اهتماما وmucins كهدف علاجي. فهم أفضل للإنتاج ووظيفة الجزيئات الميوسين قد يؤدي إلى نهج الأدوية الجديدة، على سبيل المثال، مثبطات الميوسين إيماس الحبيبية و / أو وكلاء حال للبلغم. لذلك، بروتوكولات متسقة وموثوق بها للتحقيق في علم الأحياء الميوسين حاسمة للتقدم العلمي. هنا، نحن تصف الأساليب التقليدية لفصل الجزيئات الميوسين قبل الكهربائي باستخدام هلام الاغاروز، ونقل البروتين إلى غشاء النيتروسليلوز، وكشف عن إشارة مع الأجسام المضادة الميوسين محدد وكذلك الأشعة تحت الحمراء القارئ هلام الفلورسنت. هذه التقنيات قابلة للتطبيق على نطاق واسع لتحديد الميوسين الكميات، multimerization ولاختبار آثار المركبات الدوائية على mucins.
Introduction
ويتم إنتاج Mucins عادة الأسطح المخاطية التي تبطن التجاويف يتعرض للبيئة الخارجية (على سبيل المثال، الجهاز التنفسي، الجهاز الهضمي، ومساحات الإنجابية، سطح العين)، وكذلك الأعضاء الداخلية (على سبيل المثال، البنكرياس والمرارة والغدد الثديية). وجود هذه البروتينات السكرية يحافظ على ترطيب سطح ويشكل حاجز مادي ضد مسببات الأمراض. على الرغم من أن إنتاج الميوسين ضروري لالمخاطية الصحية، الميوسين hyperconcentration و / أو خصائص مخاط الشاذة يمكن أن يؤدي إلى انسداد القناة والاستعمار الجرثومي والتهاب مزمن، والذي يمكن أن يسبب تلف الأنسجة لا رجعة فيه. ويلاحظ وجود سلسلة مشابهة من الأحداث في العديد من الأمراض، على سبيل المثال.، والتليف الكيسي 1، التهاب الأذن الوسطى المزمن 2 وإصابة عنقي مهبلي 3. وبالتالي، فمن المهم أن نفهم دور mucins في الصحة والمرض ووضع بروتوكولات روتينية لتحديد البروتين.
ان يذهب في موعد، وقد تم تحديد 19 mucins الجينات وترميز لسلاسل ببتيد كبيرة تتراوح ما بين 1200 (على سبيل المثال، MUC1) إلى 22000 (على سبيل المثال، MUC16) الأحماض الأمينية. ويمكن تقسيم الأسرة الجينات الميوسين إلى نوعين: وmucins غشاء المرتبطة، والمشاركة في الخلايا مما يشير الى سطح التدريع، وmucins تشكيل هلام، المسؤولة عن الخصائص اللزجة من المواد الهلامية المخاط. mucins غشاء المرتبطة هي في معظمها أحادى ونعلق على سطوح الخلايا عبر النطاق الذي يمتد الغشاء مسعور. في المقابل، mucins تشكيل هلام تمتلك العديد من عامل فون ويلبراند (VWF) تشبه والسيستين الغنية المجالات التي لا غنى عنها لتشكيل شبكات البوليمرية ديناميكية. وتعلق glycans كبيرة لسيرين والمخلفات ثريونين توزع في جميع أنحاء apomucin. ويمكن لهذه يغوساكاريدس كثيفة المرتبطة يا تساهم بما يصل إلى 80٪ من الوزن الجزيئي (4). داخل وبين الجزيئية السندات ثاني كبريتيد ربط أحادية الميوسين ضمان سلامة الشبكه هلام الميوسينك. ونتيجة لبالغليكوزيل الثقيلة وmultimerization، mucins هي من بين أكبر الجزيئات في عالم الحيوان ولا يمكن تحليلها من قبل الكهربائي للهلام قياسي باستخدام هلام SDS-PAGE بولي أكريلاميد التقليدية وسلالم البروتين القياسية. هذه الأساليب حل / البروتينات منفصلة مع الأوزان الجزيئية أقل من 250 كيلو دالتون في حين أحادية الميوسين يمكن أن تصل إلى 2 نجمة داود الحمراء في حالة MUC16. ومع ذلك، وارتفاع الوزن الجزيئي بروتين سلالم يمكن استخدامها لدراسة أحادية الميوسين صغيرة (أي، MUC1).
مجموعة متنوعة من التقنيات يمكن تطبيقها على دراسة الميوسين الحجم والتشكل والتفاعل. تقليديا، يتم إنجاز توصيف البيوكيميائية mucins من الميوسين العزلة عبر الإيزوبيكنيكي الطرد المركزي الكثافة التدرج في المخزن تغيير طبيعة، تليها اللوني الحجم الإقصاء ومناعي (على سبيل المثال، فتحة النشاف) 5. ديناميكية و / أو متعددة زاوية تشتت الضوء توفير معلومات عن حالة بلازميدة قليلة القسيمات العينات الميوسين غنية <سوب> 1. وبالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام الطرد المركزي النطاقي المعدل جانب مناعي ونقل المجهر الإلكتروني عادة لتحديد التشكل لجزيئات mucins 6. يستخدم قياس الطيف الكتلي أيضا لتحديد mucins، كشف انشقاق بروتين وتحليل قليل السكاريد 1،7،8 التكوين. هذه التقنيات مكلفة ومستهلكة للوقت وغالبا ما تتطلب كميات كبيرة و / أو تركيزات عالية من العينة. منهجية وصفت هنا، أي، الميوسين الفاصل الكهربائي، غير قابلة للتكرار، منخفضة التكلفة، ويمكن استخدامها في دراسات الإنتاجية العالية لتوفير النسبية الكميات الميوسين والتحقيق التجمع البوليمر. ومع ذلك، هذا الاختبار يتطلب عالية تقارب وعالية الدقة-الميوسين الأجسام المضادة التي قد لا تكون متاحة للmucins نادرة (على سبيل المثال، MUC19) أو أنواع معينة (على سبيل المثال، خنزير، النمس).
النشاف الغربي الاغاروز مناسبة لحل مجموعة واسعة من عينات الميوسين غني مع concentraستعقد بدءا من 50 ميكروغرام / مل (على سبيل المثال، يغسل الخلية) إلى 5 ملغ / مل (على سبيل المثال، البلغم). وقدم هذا الاختبار في 1990s، وأجري إلا في عدد قليل من المختبرات المتخصصة 9،10. في البداية، وقد ساعدت هذه التقنية تحديد جزء من السكان أحادية الميوسين في إفرازات الجهاز التنفسي الإنسان 11،12 وأكدت عملية oligomerization في الخلايا الكأسية، والذي يتألف من تشكيل ديمر في الشبكة الإندوبلازمية تليها multimerization ديمر في جهاز جولجي 13. وفي الآونة الأخيرة، وتوليد الأجسام المضادة ضد mucins الفئران تسهيل دراسات على نماذج حيوانية صغيرة (على سبيل المثال، الميوسين ناقصة، نماذج الماوس βENaC، OVA تحدى) وفتح مجال جديد للبحث عن الدراسات قبل السريرية مركبات اختبار الدوائية تهدف إلى إزالة المخاط من الرئتين 14-17. ونتيجة لاهتمام متزايد في الميوسين البيولوجيا وتوليد رواية، والأجسام المضادة الميوسين أكثر تحديدا، وصفنا hereiن منهجية لفصل mucins بواسطة الكهربائي للهلام الاغاروز، ونقل فراغ لالنيتروسليلوز وهما لونا كشف الفلورسنت الأشعة تحت الحمراء.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول الميوسين النشاف الغربي هو موضح في هذا الفيديو يجمع بين التقنيات التقليدية المستخدمة في البيولوجيا الجزيئية لفصل ونقل الجزيئات الكبيرة، مثل الحمض النووي، مع التقنيات العادية للكشف عن البروتين، أي، immunoblotting. ويمكن تطبيق نفس التقنية لدراسة بيولوجيا الج?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Dr. John Sheehan and Dr. Lubna Abdullah for their guidance and mentoring that were central in the completion of this work. This work was supported by funds from the National Institutes of Health (P01HL108808, UH2HL123645) and the Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics, Inc. (EHRE07XX0). Kathryn Ramsey is supported by an NHMRC Early Career Research fellowship.
Materials
| Tris Base | Sigma | T6060-1kg | 1kg |
| Glacial Acetic Acid | Sigma | ARK2183-1L | 1L |
| EDTA | Sigma | EDS-100g | 100g |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | 1L |
| Bromophenol Blue | Sigma | 114391-5g | 5g |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Sigma | L6026-50g | 50g |
| 20X SSC (Sodium Saline Citrate) Buffer | Promega | V4261 | 1L |
| NaCl | Fisher | S271-1 | 1kg |
| Trisodium Citrate (Na3C6H5O7) | Sigma | W302600-1kg | 1kg |
| 10 mM DTT (dithiothreitol) | Sigma | D0632 | 25g |
| Milk Powder | Saco | Instant non-fat dry milk | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Gibco lifetechnologies | 14200-025 | 500mL |
| Anti-GFP Goat Primary Antibody (mouse samples) | Rockland antibodies and assays | 600-101-215 | 1 mg |
| UNC 222 Anti-Muc5b Rabbit Primary Antibody (mouse samples) | UNC | ||
| H300 Anti-MUC5B Primary Antibodies (human samples) | Santa Cruz | sc-20119 | 200ug |
| 45M1 Anti-MUC5AC Primary Antibodies (human samples) | Abcam | ab3649 | 100ug |
| Donkey Anti-rabbit 800CW IR Dye | LI-COR Biosciences | 926-32213 | 0.5mg |
| Donkey Anti-mouse 680LT IR Dye | LI-COR Biosciences | 926-68022 | 0.5mg |
| Electrophoresis Gel Box and Casting Tray | Owl Seperation Systems | ||
| Power Supply Box | Biorad | Model 200/20 | |
| Membrane Blotting Paper | Amersham | 10600016 | |
| Whatman Paper and Nitrocellulose membrane | GE | 10 439 196 | |
| Boekel/Appligene Vacuum Blotter 230v | Expotech USA | 230600-2 | |
| Odyssey Infrared Fluorescence System | LI-COR Biosciences |
Riferimenti
- Henderson, A. G., et al. Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyperconcentration and increased osmotic pressure. J Clin Invest. 124 (7), 3047-3060 (2014).
- Preciado, D., et al. MUC5B Is the predominant mucin glycoprotein in chronic otitis media fluid. Pediatr Res. 68 (3), 231-236 (2010).
- Wang, Y. Y., et al. IgG in cervicovaginal mucus traps HSV and prevents vaginal herpes infections. Mucosal Immunol. 7 (5), 1036-1044 (2014).
- Linden, S. K., Sutton, P., Karlsson, N. G., Korolik, V., McGuckin, M. A. Mucins in the mucosal barrier to infection. Mucosal Immunol. 1 (3), 183-197 (2008).
- Thornton, D. J., et al. Mucus glycoproteins from ‘normal’ human tracheobronchial secretion. Biochem J. 265 (1), 179-186 (1990).
- Kesimer, M., Makhov, A. M., Griffith, J. D., Verdugo, P., Sheehan, J. K. Unpacking a gel-forming mucin: a view of MUC5B organization after granular release. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 298 (1), L15-L22 (2010).
- Kesimer, M., Sheehan, J. K. Mass spectrometric analysis of mucin core proteins. Methods Mol Biol. 842, 67-79 (2012).
- van der Post, S., Thomsson, K. A., Hansson, G. C. Multiple enzyme approach for the characterization of glycan modifications on the C-terminus of the intestinal MUC2mucin. J Proteome Res. 13 (12), 6013-6023 (2014).
- Thornton, D. J., Carlstedt, I., Sheehan, J. K. Identification of glycoproteins on nitrocellulose membranes and gels. Methods Mol Biol. 32, 119-128 (1994).
- Thornton, D. J., Carlstedt, I., Sheehan, J. K. Identification of glycoproteins on nitrocellulose membranes and gels. Mol Biotechnol. 5 (2), 171-176 (1996).
- Sheehan, J. K., et al. Physical characterization of the MUC5AC mucin: a highly oligomeric glycoprotein whether isolated from cell culture or in vivo from respiratory mucous secretions. Biochem J. 347 Pt 1, 37-44 (2000).
- Thornton, D. J., Howard, M., Khan, N., Sheehan, J. K. Identification of two glycoforms of the MUC5B mucin in human respiratory mucus. Evidence for a cysteine-rich sequence repeated within the molecule. J Biol Chem. 272 (14), 9561-9566 (1997).
- Sheehan, J. K., et al. Identification of molecular intermediates in the assembly pathway of the MUC5AC mucin. J Biol Chem. 279 (15), 15698-15705 (2004).
- Ehre, C., et al. Overexpressing mouse model demonstrates the protective role of Muc5ac in the lungs. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (41), 16528-16533 (2012).
- Livraghi, A., et al. Airway and lung pathology due to mucosal surface dehydration in {beta}-epithelial Na+ channel-overexpressing mice: role of TNF-{alpha} and IL-4R{alpha} signaling, influence of neonatal development, and limited efficacy of glucocorticoid treatment. J Immunol. 182 (7), 4357-4367 (2009).
- Martino, M. B., et al. The ER stress transducer IRE1beta is required for airway epithelial mucin production. Mucosal Immunol. 6 (3), 639-654 (2013).
- Nguyen, L. P., et al. Chronic exposure to beta-blockers attenuates inflammation and mucin content in a murine asthma model. Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (3), 256-262 (2008).
- Papakonstantinou, E., et al. COPD exacerbations are associated with pro-inflammatory degradation of hyaluronic acid. Chest. , (2015).
- Abdullah, L. H., Wolber, C., Kesimer, M., Sheehan, J. K., Davis, C. W. Studying mucin secretion from human bronchial epithelial cell primary cultures. Methods Mol Biol. 842, 259-277 (2012).
