Détermination de biofilm Initiation sur les cellules infectées par le virus par les bactéries et les champignons

Summary

A method is described herein for the determination of inter-Kingdom association and competition (bacterial and fungal) for adherence to virus-infected HeLa cell monolayers. This protocol can be extended to multiple combinations of prokaryotes, eukaryotes, and viruses.

Abstract

L'étude des interactions polymicrobienne à travers les royaumes taxonomiques qui incluent les champignons, les bactéries et les virus n'ont pas été examinés précédemment en ce qui concerne la façon dont les membres virales du microbiome affectent les interactions microbiennes ultérieures avec ces cellules hôtes infectées par le virus. La cohabitation de virus avec des bactéries et des champignons est principalement présent sur les surfaces muqueuses de la cavité buccale et du tractus génital. les cellules des muqueuses, en particulier ceux avec des infections virales latentes chroniques ou persistantes persistants, pourraient avoir un impact significatif sur les membres du microbiome par altération du virus en nombre et le type de récepteurs exprimés. La modification de l'architecture de la membrane de la cellule hôte entraînerait une capacité altérée de nouveaux membres de la flore normale et des agents pathogènes opportunistes pour initier la première étape dans la formation de biofilm, à savoir l' adhérence. Cette étude décrit une méthode pour la quantification et l'examen visuel de l'effet de HSV sur l'ouverture de BIOFILla formation de m (d'adhésion) de S. aureus et C. albicans.

Introduction

Le microbiome humain comprend divers organismes provenant de plusieurs royaumes taxonomiques qui partagent des régions géographiques dans le corps. L'adhésion à la surface des cellules est une première étape essentielle dans la formation de biofilm, qui fait partie du processus de colonisation microbiome. Inclus dans le microbiome peuvent être des virus qui causent des infections chroniques et persistantes. L'infection chronique des cellules par ces virus peut provoquer une altération de la disponibilité du récepteur putatif. ^1,2 En outre, l' entrée de la cellule par des agents pathogènes intracellulaires pourrait également affecter la fluidité de la membrane hôte / hydrophobie qui à son tour peut modifier l' attachement des autres membres du microbiome, y compris les bactéries et les champignons . Afin de comprendre les interactions qui peuvent se produire entre ces multiples agents pathogènes qui co-localisent dans les mêmes régions géographiques de l'hôte humain, nous devons être en mesure d'étudier l'interaction des agents pathogènes qui représentent le spectre des royaumes taxonomiques présents à la surface de la muqueuse.

t "> Le Herpesviridae sont une famille de microbes présents dans 100% des humains en tant que membres permanents du microbiome ^3,4. En outre , ils peuvent également être constamment versé à la fois en présence et en l' absence de symptômes. Plus précisément, l' herpès simplex virus-1 et l'herpès simplex virus 2 (HSV-1 et HSV-2, respectivement) sont membres permanents du microbiome dans le oronasopharynx et l'appareil génital. chez les personnes immunocompétentes, HSV-1 et HSV-2 provoquent gingivostomatite, ainsi que herpès génital ^5-8. sur ces sites, HSV provoque une infection latente caractérisée par une nécrose chronique persistante virale asymptomatique excrétion ^9. entrée de HSV dans des cellules conduit à des altérations de l' expression de surface de nectins, l' héparane sulfate, les radeaux lipidiques et herpesvirus entrée médiateur / tumeur récepteur du facteur (HVEM / TNFR) ^10-25. Ces récepteurs potentiellement représentent partagés pour certaines bactéries et les champignons, par exemple S. aureus et C. albicans, qui , bien que des agents pathogènes opportunistes,peuvent également résider en tant que membres du microbiome de la muqueuse de l'oronasopharynx ^26,27. Au sein de la oronasopharynx S. aureus et C. Albicans occupent deux sites distincts de la colonisation. Dans des hôtes avec des dents naturelles, la muqueuse buccale est partagée par le HSV-1 et C. albicans, tandis que les nares nasales antérieures sont occupées par S. aureus ^28. Cependant, les résultats malgré in vitro que S. aureus adhère aux cellules épithéliales de la bouche, ^29,30 S. aureus est rarement isolé à partir d' échantillons oraux lorsque le tissu normal est présent ^29,30. On sait peu concernant génitales niches voies co-colonisation au – delà des résultats cliniques que S. aureus est associé à la vaginite aérobie, caractérisée par une inflammation génitale, la décharge et la dyspareunie, tandis que C. Albicans produit des lésions des muqueuses semblables à celles observées dans la cavité buccale ^31-35. Ainsi, bien que ces membres de la microbi orale et génitaleertains royaumes taxonomiques croisées peu est connu au sujet de leur interaction que son impact sur ​​leur capacité à initier la formation de biofilm par l' adhésion à la surface de la cellule hôte ^5. Ce protocole a été appliqué de manière efficace afin de déterminer les conséquences fonctionnelles de co-colonisation / infection.

Protocol

1. HSV Souches et Manipulation Note: Recombinant non-propagation de HSV-1 (KOS) gL86 et HSV-2 (KOS) 333gJ – avec l' activité du rapporteur bêta-galactosidase utilisés ont été fournis par V. Twiari 36,37. Utiliser des virus à partir d'un lot unique et stocker à -80 ° C, à un rapport 1: 1 de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec 20% de sérum de fœtus bovin (FBS) et le lait écrémé jusqu'à utilisation. Avant le stockage du lot viral, déterminer…

Representative Results

Le niveau de la solidité des données obtenues à partir du système décrit dans le présent rapport est illustré à la figure 2 af 38. Grâce à l'utilisation de ce système, la modulation de l'interaction staphylococcique et fongique avec des cellules infectées par des virus et de leur effet sur l'adhésion de l'autre peut être délimitée. Ces types d'études nécessitent un examen au microscope de l'interaction , comme illustr?…

Discussion

Actuellement , aucune information est disponible sur les interactions complexes entre permanent aux membres semi-permanents du microbiome hôte qui traversent plusieurs domaines taxonomiques, à savoir, procaryotes, eucaryotes et virales. Nous avons donc développé un roman dans le système de modèle in vitro pour étudier biofilm initiation par S. aureus et C. albicans sur le HSV-1 ou HSV-2 infectées HeLa 229 ⁽³⁸ HeLa). Le système de modèle de cellules HeLa p…

Materials

C.albicans
BBL Sabouraud Dextrose	BD	211584
Fungisel Agar	Dot Scientific	7205A
S.aureus
Mannitol Salt Agar	Troy Biologicals	7143B
Sheep blood agar	Troy Biologicals	221239
Hela cells
1xDMEM (Dubelcco's Modified Eagle Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate	Corning	10-017-CM
Gentamicin 50mg/ml	Sigma	1397	50µg/ml final concentration in the complete DMEM
Trypsin EDTA (0.05% Trypsin, 0.53M EDTA)Solution 1X	Corning	25-052-CI
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11150	10% final concentration in the complete DMEM
Other medium and reagents
ONPG	Thermo Scientific	34055
Ultra-Pure X gal	Invitrogen	15520-018
1x HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution)	Corning	20-021-CV
1XPBS	Dot Scientific	30042-500
RIPA Lysis	Life Technologies	89901
Staining
Methanol	Fisher Scientific	A433P-4
HSV 1&2, specific for gD	ViroStat	196
DAPI	SIGMA	D8417-5MG
Gram Crystal Violet	Troy Biologicals	212527
Supplies
Petri dish 100X15	Dot Scientific	229693
Petri dish 150X15	Kord Valmark	2902
96-Well plates	Evergreen Scientific	222-8030-01F
24-well plates	Evergreen Scientific	222-8044-01F
Culture tubes 100×13	Thomas Scientific	9187L61
Cover slip circles, 12mm	Deckglaser	CB00120RA1