Vacciniavirus (VV) har använts i stor utsträckning inom biomedicinsk forskning och förbättring av människors hälsa. Den här artikeln beskriver en enkel, effektiv metod för att redigera VV-genomet med hjälp av en crispr-Cas9 systemet.
The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.
Vacciniavirus (VV) är ett hölje DNA-virus som tillhör poxvirus familjen och har spelat en avgörande roll i en av de största framgångarna inom medicin att utrota smittkoppor. I en tid präglad av smittkoppor efter utrotning har VV utvecklats som en vektor för att leverera gener för vacciner mot HIV och andra infektionssjukdomar 1-7 genom att sätta in gener från olika patogener i VV vektorer. VV har också i stor utsträckning använts som en vektor för cancerimmunterapi 8-14 speciellt för utveckling av tumörinriktade repliker onkolytiska vacciniavirus. För att skapa ett effektivt vaccin vektor med förbättrad selektivitet för cancerceller, är ändringar inom det virala genomet som krävs, inklusive gen deletioner eller införande av terapeutiska gener.
Med utvecklingen av DNA-teknik och en bättre förståelse av molekylärbiologi och virologi, insättning av främmande DNA i VV ursprungligen uppnåd med hjälp av homolog rekombination (HR) i 1980 15. Denna metod är fortfarande i stor utsträckning använts för att konstruera VV vektorer. Införande av den genetiska modifieringen uppnås genom att använda en skyttelvektor för HR, som rekombinerar med VV-genomet i pre-infekterade celler. Emellertid har denna metod visat sig vara mycket ineffektiv (mindre än 1% homolog rekombination effektivitet 16) och resulterar ofta i slumpvis insättning av selektionsmarkören i icke-riktade regioner och / eller förlust av markören vid expansion virus.
Effektiviteten av DNA homolog rekombination för insättning av exogent DNA vid genomisk loci kan dramatiskt förbättrad i närvaro av dubbelsträngsbrott (DSB) 17. Därför håller den teknik som kan framkalla DSB på mål loci stor potential för genom konstruktion av VV.
Den nyligen utvecklade crispr-Cas9 systemet visar löfte för att utlösa DSB i någon VV genregion. Crispr-Cas9 är en RNA-guidad nukleas inblandade i adaptiv immunitet mot invaderande fager och andra främmande genetiskt material 18-20. Det finns tre crispr-Cas-system i ett område av mikrobiella arter 21. Typ II crispr-Cas-systemet används i stor utsträckning för redigering av genomet hos eukaryota celler och stora virus. Den består av RNA-styrda Cas9 endonukleas (från Streptococcus pyogenes), en enda styr RNA (sgRNA) och transaktiverande crRNA (tracrRNA) 22-24. Den Cas9 / sgRNA komplexet igenkänner den komplementära 20-nukleotid-genomisk sekvens som föregår en 5'-NGG-3 'Protospacer intilliggande motiv (PAM) sekvens i däggdjursceller 22, 23. Det har med framgång använts för effektiv generering av genetiskt modifierade celler, virus och djurmodeller 22-32.
Den crispr-Cas9 systemet har visat sig vara ett effektivt verktyg för genom inriktning i kombination med homolog rekombination i cytoplasman av VV infekterade CV-1 cells för att generera muterade vacciniavirus 33, 34. För att utvidga den potentiella tillämpningen av denna metod, presenterar vi detaljerad information om detta system metodik. Det beskrivna protokollet kan användas för att skapa en mutant VV med en särskild gen deletion och / eller arm mutantviruset med en terapeutisk transgen.
Det finns två huvudsakliga mål för modifiering av VV i terapeutiska syften. En är att ta bort en särskild gen, såsom tymidinkinas (TK) genen för att attenuera viruset för anti-tumör terapeutisk användning. Den andra är att armen VV med en önskad terapeutisk gen (t.ex. GM-CSF) eller en markörgen (såsom luciferas-genen). Uppnå någon av dessa innebär en strykning av ett målområde / gen. En direkt DNA ligation metod 35 och en in vitro förpackningsmetod 36 har använts tidigare för att generera mutanta vacciniavirus med TK förändringar av gener. Emellertid har dessa metoder begränsad ansökan avseende mutation av andra regioner i genomet på grund av brist på unika restriktionsenzymställen i hela genomet. Den nuvarande strategin för att skapa muterade VV innebär transfektion av en skyttel (donator) vektor med en selektionsmarkör (RFP eller GFP) i CV-1-celler två timmar efter infektion med VV att framkalla en homolog rekombination incorporating selektionsmarkören i målregionen. Val av markörpositiva plack följs av deras rening 24 h efter transfektion. Plack reningsprocessen kan ta upp till 10 omgångar, senast 3-4 veckor och ofta leder till oönskade rekombinanta virus med selektionsmarkörer insatta i off-målområden. DNA dubbel-strängbrott effektivt kan inducera homolog rekombination i däggdjursceller 37, och genom att utnyttja denna mekanism, kan effektiviteten att generera muterade VV vara betydligt bättre. Den gRNA styrda Cas9 systemet har använts med framgång i genomet redigering och effektiviserar homolog rekombination i eukaryota organismer 22, 25. Nyligen, i värdceller genomen hos adenovirus och typ I herpes simplex-virus redigerats av gRNA styrda Cas9 systemet 24. Det har nyligen visats att crispr Cas9 system är ett kraftfullt verktyg för att effektivt redigering av VV-genomet och konstruera en VV vektor för uttryck av ensärskild gen.
Både N1L gRNA styrd Cas9 och traditionella homolog rekombination (HR) metod resulterade i framgångsrika HR evenemang på samma målplatsen av N1L. Intressant, men gRNA styrd Cas9 inducerad HR på mycket högre nivåer av effektivitet än den traditionella HR-metoden. Således, användning av gRNA-guided Cas9 eliminerar behovet att rena så många placker för att erhålla mutanta VVS. I detta arbete har vi förbättrat avsevärt effektiviteten och tidsramen för generering av mutant VV med hjälp av gRNA styrda Cas9 systemet 33. Att notera är en kritiskt steg för att erhålla en hög effektivitet av homolog rekombination för att transfektera CV-1-celler med plasmiderna uttryckande Cas9 och gRNA i 24 h innan du utför den konventionella homolog rekombination. 24 h intervall tillåter Cas9 och gRNA uttryckas på en rimlig nivå. Vidare kan gRNA sekvens rikta en särskild gen måste optimeras som vi funnit att de olika gRNA sekvenser targeting N1L genen varierade i deras effektivitet 33, 34.
Begränsningen för crispr / Cas9 i redigerings VV är den låga RFP-positiva plack i den första omgången av rekombination. För att erhålla ett tillräckligt antal RFP-positiva placker innehållande rekombinant virus, vanligen minst tio 6-brunnars plattor som behövs, vilket gör första omgången screening långtråkig. Det finns därför fortfarande ett behov att optimera protokoll för att övervinna denna begränsning.
Den lilla storleken på RFP positiva plack är ett annat potentiellt problem, som beror på en hög volym av lysat användes för att infektera en 6-brunnsplatta. För att lösa detta, bör en mindre volym av lysat användas för att infektera en 6-brunnars platta för erhållande av större storlek RFP-positiva plack. Med användning av en mindre volym av lysat kommer också att möjliggöra för bättre separation av RFP-positiva plack från de RFP-negativa sådana. Följaktligen färre omgångar av plackrening krävs för att få rena RFP-positiva plack.
<pclass = "jove_content"> Off-mål effekter är alltid en oönskad fråga i genen redigering. Crispr-Cas9 har visat off-mål effekter. Men med noggrann utformning av gRNA, off-target effekter kan undvikas när du redigerar VV genomen 33, 34. Detta är särskilt fördelaktigt att använda gRNA styrda Cas9 systemet för redigering av genomet hos VV. Med tanke på de löften om VV, med hjälp av crispr / Cas9-systemet kommer att påskynda utvecklingen av muterade VVS för biomedicinsk forskning och i translationell medicin. Dessutom skulle ett sådant system också påskynda upptäckter i cellbiologi, såsom dissektion av de signalvägar som används av VV för sin aktin baserad rörlighet.The authors have nothing to disclose.
This work was supported by The MRC DPFS grant (MR/M015696/1) and Ministry of Sciences and Technology of China (2013DFG32080).
Plasmid #41824 | 41824 | Addgene | gRNA cloning vector |
pST1374 | 13426 | Addgene | Cas9 cloning vector |
pGEMT easy | A1360 | promega | repair donor vector cloning |
One Shot TOP10 Chemically Competent E .Coli | C4040-10 | Invitrogen | transformation |
QIAprep Spin Miniprep Kit | 27106 | Qiagen | plasmid extraction |
Dulbecco’s Eagle’s Medium (DMEM) | 11965-092 | Life Technologies | cell culture medium |
fetal bovine serum (FBS) | SH30088.03HI | Hyclone | cell culture serum |
penicillin, streptomycin | 15070-063 | Thermo Scientific | antibiotics |
Effectene | 301425 | Qiagen | transfection |
Thermo Scientific Nalgene Cryogenic vial; 2.0 mL | W-06754-96 | Thermo Scientific | collect virus |
fluorescence microscope | Olympus BX51 Fluorescence | Olympus | find RFP-positive plque |
DNeasy Blood & Tissue Kit | 69506 | Qiagen | DNA extraction |
Extensor Long PCR ReddyMix Master Mix | AB-0794/B | Thermo Scientific | PCR reagent |
10cm culture dish | Z688819-6EA | sigma | cell culture |
6-well plate | Z707759 | sigma | cell culture |
cell scraper | C5981 | sigma | scrap cells |
1XTrypsin-EDTA solution | T4299 | sigma | trypsinize cells |
Virkon | 95015661 | Anachem Ltd | desinfectant |
Falcon tube | CLS430791-500EA | Sigma | hold cell suspension |
N1L forward 5’-TATCTAGCAATGGACCGT-3’ | Sigma | PCR primer | |
N1L reverse 5’-CCGAAGGTAGTAGCATGGA-3' | Sigma | PCR primer | |
A52R forward 5’-ATAGGATTGTGTGCATGC-3’ | Sigma | PCR primer | |
A52R reverse 5’-TTGCGGTATATGTATGAGGTG-3’ | Sigma | PCR primer | |
RFP forward 5’- GCTACCGGACTCAGATCCA-3’ | Sigma | PCR primer | |
RFP reverse 5’-CGCCTTAAGATACATTGATGAG-3’ | Sigma | PCR primer | |
Argarose | A7431 | Sigma | resolve PCR product |
G:BOX F3 | G:BOX F3 | Syngene | UV gel doc |