En effektiv metod för att få avdifferentierade fettceller

Summary

We have modified the conditions for DFAT cell generation and provide herein information regarding the use of an improved growth medium for the production of these cells.

Abstract

Tissue engineering och cellterapi är mycket lovande kliniskt. I detta avseende kan multipotenta celler, såsom mesenkymala stamceller (MSC), användas terapeutiskt, i en nära framtid, för att återställa funktionen i skadade organ. Ändå flera tekniska frågor, bland annat den mycket invasiva förfarandet för att isolera MSC och ineffektivitet kring sin förstärkning, för närvarande hindrar den potentiella kliniska användningen av dessa terapeutiska modaliteter. Häri presenterar vi en mycket effektiv metod för generering av avdifferentierade fettceller (DFAT), MSC-liknande celler. Intressant nog kan DFAT celler differentieras i flera celltyper inklusive adipogena, osteogena och kondrogena celler. Även andra grupper har tidigare presenterat olika metoder för att generera DFAT celler från mogna fettvävnad, gör att vår metod för oss att producera DFAT celler mer effektivt. I detta hänseende, visar vi att DFAT odlingsmedium (DCM), kompletterat med 20% FBS,är mer effektiv i att generera DFAT celler än DMEM, kompletterat med 20% FBS. Dessutom kan DFAT celler som produceras av vår cellodlingsmetod redifferentiated i flera vävnadstyper. Som sådan, är en mycket intressant och användbar modell för studier av vävnads dedifferentiering presenteras.

Introduction

Cellterapi och vävnadsteknik är heta ämnen inom området regenerativ medicin ^1-5. Även om dessa terapeutiska modaliteter är mycket lovande, flera tekniska frågor som för närvarande hindrar deras kliniska användning. I detta avseende, som i genereringen av iPS-celler måste alla vävnadstekniska terapier producera celler fria från externa gen transduktioner för att upprätthålla patientsäkerheten. Följaktligen var vi den första gruppen att framgångsrikt producera humana DFAT celler ^6. Flera andra forskargrupper har sedan antagit vår metod för att generera DFAT celler av däggdjursursprung ^7-9, ytterligare lyfta fram nyttan av vår modell.

Under loppet av flera studier har vi funnit att kvaliteten hos cellodlingsmiljön kan modifieras genom justering av innehållet i cellmediet. Denna upptäckt har lett till en ökning av andelen framgångsrika DFAT cellproduktion och förbättrad cellkvalitet; båda kritiska faktorer ieffektivt generera celler för framtida kliniska prövningar. I detta avseende, en förbättrad DFAT odlingsmedium (DCM, en substans liknande mesenkymal stamcell medium, som innehåller rekombinant humant insulin, serumalbumin, L-glutaminsyra, flera fettsyror och kolesterol) och en metod för DFAT cellgenerering och spridning utvecklades (mer information om innehållet i DCM finns tillgänglig på begäran). Användning av denna metod högkvalitativa DFAT celler genererades med förmågan att differentiera till flera celltyper, inklusive adipogena, osteogena och kondrogena celler. Sammantaget ökar detta validerade cellodlings protokoll kvaliteten på DFAT celler och kan vara mycket användbar för att förbättra kliniska tillämpningar av cellterapi och vävnadsteknik.

Protocol

Prover av human underhudsfett erhölls från patienter som genomgår kirurgi i departementen plastikkirurgi, urologi, Pediatric Surgery och ortopedisk kirurgi i Nihon University Itabashi Hospital (Tokyo, Japan). Patienterna gav skriftligt informerat samtycke, och etikkommittén av Nihon University School of Medicine godkände studien. 1. Vävnadsberedning Frammatning av provet vävnad från operationsrummet till laboratoriet. Tvätta 1-2 g fettvävnad med 5 ml PBS (-) vi…

Representative Results

I denna studie var metoden och verktyg för DFAT cell generation förbättras (Figur 1). Vår metod ger oss möjlighet att generera DFAT celler med användning av både DCM och DMEM-medium innehållande 20% FBS (Figur 2A). Som sådan, jämförde vi effektiviteten i DCM och DMEM vid generering DFAT celler. I detta avseende förbättrad DCM DFAT cellproliferation genom tre gånger jämfört med DMEM, oberoende av antalet adipocyter (Figur 2A<…

Discussion

Mogna adipocyter som genomgår in vitro dedifferentiering, en process som kallas tak kultur, kan återgå till en mer primitiv fenotyp och få proliferativa förmågor. Dessa celler benämns dedifferentierade fett (DFAT) celler. utvärderades den multilineage differentieringspotential DFAT celler. Flödescytometrianalys och genuttryck analys visade att DFAT celler var mycket homogena i jämförelse med DSK: er ^6. I själva verket är det cellyteantigen profil DFAT celler som liknar dem som finns i DS…

Materials

CSTI303-MSC medium	CSTI	87-671	This medium is defined as DCM in the text
PBS(-)	Wako	166-23555	It does not contain Mg2+ and Ca2+
DMEM medium	Gibco	11965-092
Fetal Bovine Serum	Sigma	172012
Collagenase type II	Sigma	C-6885
Scissors	Takasago Medical Industry Co., Ltd	TKZ-F2194-1
Shaker	TAITEC	Bioshaker V.BR-36
Falcon Cell Strainer 100um Yellow	CORNING LIFE SCIENCES	DL 352360
Falcon 12.5cm² Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Blue Vented Screw Cap	CORNING LIFE SCIENCES	353107
18G needle	NIPRO	02-002
20ml Syringe	NIPRO	08-753
Z Series Coulter Counter	BECKMAN COULTER	383550