Kinetische Messung und Echtzeit-Visualisierung von Somatic Reprogrammierung
Summary
Das Protokoll in dieser Studie präsentierten beschreibt Verfahren zur Echtzeit-Überwachung der Reprogrammierung Progression über die kinetische Messung von positiven und negativen pluripotenten Stammzellmarker Durchflusszytometrie-Analyse. Das Protokoll enthält auch die Imaging-basierte Beurteilung der Morphologie und Marker oder Reporter-Expression während der iPS-Generation.
Abstract
Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease phenotypes. Recent advances have identified more efficient and safe methods for introduction of reprogramming factors. However, there are few tools to monitor and track the progression of reprogramming. Current methods for monitoring reprogramming rely on the qualitative inspection of morphology or staining with stem cell-specific dyes and antibodies. Tools to dissect the progression of iPSC generation can help better understand the process under different conditions from diverse cell sources.
This study presents key approaches for kinetic measurement of reprogramming progression using flow cytometry as well as real-time monitoring via imaging. To measure the kinetics of reprogramming, flow analysis was performed at discrete time points using antibodies against positive and negative pluripotent stem cell markers. The combination of real-time visualization and flow analysis enables the quantitative study of reprogramming at different stages and provides a more accurate comparison of different systems and methods. Real-time, image-based analysis was used for the continuous monitoring of fibroblasts as they are reprogrammed in a feeder-free medium system. The kinetics of colony formation was measured based on confluence in the phase contrast or fluorescence channels after staining with live alkaline phosphatase dye or antibodies against SSEA4 or TRA-1-60. The results indicated that measurement of confluence provides semi-quantitative metrics to monitor the progression of reprogramming.
Introduction
Patienten stammende induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) sind vielversprechende Werkzeuge für Zelltherapie und Wirkstoff-Screening. Sie bieten eine autologe Quelle von Zellen für die Therapie. Darüber hinaus umfassen sie ein sehr breites Spektrum an genetischen Hintergründen, eine detaillierte In – vitro – Analyse von genetischen Erkrankungen jenseits dessen, was Strom an embryonalen Stammzellen (ESC) Linien erlauben würde , zu ermöglichen. Jüngste Fortschritte haben zur Entwicklung verschiedener Methoden geführt iPSCs zur Erzeugung, einschließlich Umprogrammierung mit Sendai – Virus, episomalen Plasmiden oder mRNAs 1,2. Bemerkenswerterweise sind verschiedene Verfahren der Reprogrammierung zugeordnet Ebenen der Effizienz und Sicherheit Variation und sind wahrscheinlich auf andere Weise zu unterscheiden, die ihre Eignung für verschiedene Anwendungen beeinflussen. Mit der Verfügbarkeit von einer Vielzahl von Umprogrammierung Technologien hat es wichtig geworden, Methoden zu entwickeln, um die Reprogrammierung zu bewerten. Die meisten existierenden Verfahren stützen sich auf die qualitative Kontrolle der Morphologie oder Färbungmit Stammzell-spezifische Farbstoffe und Antikörper. Eine kürzlich entwickelte Methode nutzt lentiviralen Fluoreszenz – Reporter , die empfindlich auf PSC-spezifischen miRNAs oder differenzierte zellspezifischen mRNAs 3. Eine solche Überwachungsmethoden, die Auswahl und Optimierung der Reprogrammierung Techniken für unterschiedliche Situationen erleichtern. Zum Beispiel wurde als fluoreszierende Sonde für frühe iPSCs um zu screenen für Umprogrammierung Modulatoren 4 CDY1 verwendet. Die Fähigkeit, zu beobachten und verschiedene Umprogrammierung Experimente vergleichen ist auch entscheidend für sich ein besseres Verständnis des Verfahrens zu gewinnen. Zum Beispiel ist es nun bekannt , dass einige somatische Zelltypen leichter sind als andere umprogrammieren 5, und dass die Zellen gehen durch Zwischenzustände während 6-8 Neuprogrammierung. Leider sind die Mechanismen, die die Reprogrammierung Verfahren zugrundeliegenden noch nicht vollständig verstanden und folglich bleiben die genauen Unterschiede zwischen Umprogrammierung Methoden auch als defined. So Methoden zur Überwachung, Bewertung und Neuprogrammierung Ereignisse Vergleich weiterhin für die Stammzell-Feld kritisch zu sein.
Die Verfahren in diesem Protokoll beschrieben ermöglichen die Überwachung und Beurteilung der Umprogrammierung und zeigen, wie diese Techniken verwendet werden können, verschiedene Sätze von Umprogrammierung Reagenzien zu vergleichen. Der erste Ansatz beinhaltet Durchflusszytometrie analysiert Kombinationen von Antikörpern gegen positive und negative pluripotenten Stammzellen (PSC) Marker. Der zweite Ansatz Paare Echtzeit-Bildgebung und die Messung der Gesamt Einmündung (die Fläche Prozent Oberfläche durch die Zellen bedeckt) und Einmündung der Markierungssignale (Bereich Prozent Oberfläche durch die fluoreszierenden Signale abgedeckt).
Protocol
Representative Results
Discussion
This study provides strategies for monitoring and tracking of the reprogramming process using flow cytometry and real-time imaging-based analysis. The critical steps in the protocol are initiating reprogramming, measuring reprogramming progression based on marker expression and real-time monitoring of reprogramming. Any reprogramming method of choice can be used but here we focus on Sendai based reprogramming of human fibroblasts. The advantage of this method is the ease of use and consistent high efficiency of reprogram…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Chad MacArthur für hilfreiche Diskussionen.
Materials
| DMEM, high glucose, GlutaMAXSupplement, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 10569-010 | |
| Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified, US origin | Thermo Fisher Scientific | 16141-061 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | |
| Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts | Thermo Fisher Scientific | A24903 | |
| Attachment Factor Protein (1X) | Thermo Fisher Scientific | S-006-100 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 10565-018 | |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| Collagenase, Type IV, powder | Thermo Fisher Scientific | 17104-019 | |
| TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12563-011 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
| Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413302 | |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0264 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-020 | |
| Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | Thermo Fisher Scientific | 15260-037 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| InSolution Y-27632 | EMD Millipore | 688001 | |
| CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A1378001 | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A16517 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| BJ ATCC Human Foreskin Fibroblasts, Neonatal | ATCC | CRL-2522 | |
| DF1 Adult Human Dermal Fibroblast | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| BG01V/hOG Cells Variant hESC hOct4-GFP Reporter Cells | Thermo Fisher Scientific | R7799-105 | |
| IncuCyte ZOOM | Essen BioScience | ||
| SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate (MC813-70) | Thermo Fisher Scientific | SSEA421 | |
| SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (eBioMC-813-70 (MC-813-70)) | Thermo Fisher Scientific | A14810 | |
| SSEA-4 Antibody (MC813-70) | Thermo Fisher Scientific | 41-4000 | |
| TRA-1-60 Antibody (cl.A) | Thermo Fisher Scientific | 41-1000 | |
| CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (clone IM7), PE-Cy5 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A27094 | |
| CD44 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging | Thermo Fisher Scientific | A25528 | |
| CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (Clone IM7) | Thermo Fisher Scientific | RM-5700 (no longer available) | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11007 | |
| Alkaline Phosphatase Live Stain | Thermo Fisher Scientific | A14353 | |
| TRA-1-60 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging | Thermo Fisher Scientific | A25618 | |
| CD24 Mouse Anti-Human mAb (clone SN3), FITC conjugate | Thermo Fisher Scientific | MHCD2401 | |
| beta-2 Microglobulin Antibody, FITC conjugate (B2M-01) | Thermo Fisher Scientific | A15737 | |
| EpCAM / CD326 Antibody, FITC conjugate (VU-1D9) | Thermo Fisher Scientific | A15755 | |
| CD73 / NT5E Antibody (7G2) | Thermo Fisher Scientific | 41-0200 | |
| VECTOR Red Alkaline Phosphatase (AP) Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-5100 | |
| Zeiss Axio Observer.Z1 microscope | Carl Zeiss | 491912-0003-000 | |
| FlowJo Data Analysis Software | FLOJO, LLC | N/A | |
| Attune Accoustic Focusing Cytometer, Blue/Red Laser | Thermo Fisher Scientific | Use Attune NXT | |
| S3e Cell Sorter (488/561 nm) | BIO-RAD | 1451006 | |
| Falcon 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap | Corning | 352235 | |
| Falcon 15 mL, high-clarity, dome-seal screw cap | Corning | 352097 | |
| Falcon T-75 Flask | Corning | 353136 | |
| Falcon T-175 Flask | Corning | 353112 | |
| Falcon 6-well dish | Corning | 353046 | |
| HERAEUS HERACELL CO2 ROLLING INCUBATOR | Thermo Fisher Scientific | 51013669 | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | AM12450 | ||
| HulaMixer Sample Mixer | 15920D |
Riferimenti
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