Protokollen som presenteres i denne undersøkelse beskriver fremgangsmåter for sanntids overvåkning av reprogrammerings-progresjon gjennom den kinetiske måling av positive og negative pluripotent stamcellemarkører ved hjelp av strømningscytometri-analyse. Protokollen inneholder også bildebasert vurdering av morfologi, og markør eller reporter uttrykk under IPSC generasjon.
Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease phenotypes. Recent advances have identified more efficient and safe methods for introduction of reprogramming factors. However, there are few tools to monitor and track the progression of reprogramming. Current methods for monitoring reprogramming rely on the qualitative inspection of morphology or staining with stem cell-specific dyes and antibodies. Tools to dissect the progression of iPSC generation can help better understand the process under different conditions from diverse cell sources.
This study presents key approaches for kinetic measurement of reprogramming progression using flow cytometry as well as real-time monitoring via imaging. To measure the kinetics of reprogramming, flow analysis was performed at discrete time points using antibodies against positive and negative pluripotent stem cell markers. The combination of real-time visualization and flow analysis enables the quantitative study of reprogramming at different stages and provides a more accurate comparison of different systems and methods. Real-time, image-based analysis was used for the continuous monitoring of fibroblasts as they are reprogrammed in a feeder-free medium system. The kinetics of colony formation was measured based on confluence in the phase contrast or fluorescence channels after staining with live alkaline phosphatase dye or antibodies against SSEA4 or TRA-1-60. The results indicated that measurement of confluence provides semi-quantitative metrics to monitor the progression of reprogramming.
Pasient-avledet induserte pluripotente stamceller (iPSCs) er lovende verktøy for celleterapi og narkotika screening. De gir en autolog kilde til celler for terapi. I tillegg omfatter de et meget bredt sett av genetiske bakgrunn, slik at en detaljert in vitro analyser av genetiske sykdommer utover det nåværende embryonale stamceller (ESC) linjer ville tillate. Nylige fremskritt har ført til utvikling av flere metoder for å generere iPSCs, inkludert omprogrammering med Sendai-virus, episomale plasmider eller mRNA 1,2. Spesielt er forskjellige omprogrammering metoder forbundet med varierende grad av effektivitet og sikkerhet, og vil sannsynligvis variere på andre måter som påvirker deres egnethet for ulike bruksområder. Med tilgjengeligheten av en rekke reprogrammerings-teknologi, har det blitt viktig å utvikle metoder for å vurdere den omprogrammering prosessen. De fleste eksisterende metoder er avhengige av den kvalitative inspeksjon av morfologi eller beisingmed stamcelle-spesifikke fargestoffer og antistoffer. En nylig utviklet metode gjør bruk av lentivirale fluorescens reportere som er følsomme for PSC-spesifikk mirnas eller differensierte celle-spesifikke mRNA 3. Slike målemetoder forenkle valg og optimalisering av omprogrammering teknikker for ulike situasjoner. For eksempel har CDy1 blitt brukt som en fluorescerende probe for tidlig iPSCs for å screene for reprogrammerings-modulatorer 4. Evnen til å observere og sammenligne ulike reprogrammerings eksperimenter er også kritisk for å få en bedre forståelse av prosessen i seg selv. For eksempel er det nå kjent at noen somatiske celletyper er lettere å omprogrammere enn andre, 5, og at celler går gjennom mellomliggende tilstander ved reprogrammering 6-8. Dessverre, mekanismene bak omprogrammering prosessen er fortsatt ikke helt forstått og dermed den eksakte forskjeller mellom omprogrammering metoder også gjenstår å være defined. Dermed metoder for overvåking, vurdering, og sammenligne omprogrammering hendelser fortsetter å være kritisk for stamcellefeltet.
Metodene som beskrives i denne protokollen tillater overvåkning og vurdering av de reprogrammerings-prosessen, og illustrerer hvordan disse teknikkene kan anvendes for å sammenligne forskjellige sett med omprogrammering reagenser. Den første tilnærmingen innebærer flowcytometri analyser ved hjelp av kombinasjoner av antistoffer mot positive og negative pluripotent stamcelle (PSC) markører. Den andre tilnærmingen par sanntids avbildning og måling av total konfluens (det prosentvise overflateareal som dekkes av cellene) og løpet av markørsignaler (det prosentvise overflateareal som dekkes av de fluorescerende signaler).
This study provides strategies for monitoring and tracking of the reprogramming process using flow cytometry and real-time imaging-based analysis. The critical steps in the protocol are initiating reprogramming, measuring reprogramming progression based on marker expression and real-time monitoring of reprogramming. Any reprogramming method of choice can be used but here we focus on Sendai based reprogramming of human fibroblasts. The advantage of this method is the ease of use and consistent high efficiency of reprogram…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Chad MacArthur for nyttige diskusjoner.
DMEM, high glucose, GlutaMAXSupplement, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 10569-010 | |
Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified, US origin | Thermo Fisher Scientific | 16141-061 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | |
Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts | Thermo Fisher Scientific | A24903 | |
Attachment Factor Protein (1X) | Thermo Fisher Scientific | S-006-100 | |
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 10565-018 | |
KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
2-Mercaptoethanol (55 mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
Collagenase, Type IV, powder | Thermo Fisher Scientific | 17104-019 | |
TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12563-011 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413302 | |
Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | |
FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0264 | |
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-020 | |
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | Thermo Fisher Scientific | 15260-037 | |
HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
InSolution Y-27632 | EMD Millipore | 688001 | |
CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A1378001 | |
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A16517 | |
Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
BJ ATCC Human Foreskin Fibroblasts, Neonatal | ATCC | CRL-2522 | |
DF1 Adult Human Dermal Fibroblast | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
BG01V/hOG Cells Variant hESC hOct4-GFP Reporter Cells | Thermo Fisher Scientific | R7799-105 | |
IncuCyte ZOOM | Essen BioScience | ||
SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate (MC813-70) | Thermo Fisher Scientific | SSEA421 | |
SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (eBioMC-813-70 (MC-813-70)) | Thermo Fisher Scientific | A14810 | |
SSEA-4 Antibody (MC813-70) | Thermo Fisher Scientific | 41-4000 | |
TRA-1-60 Antibody (cl.A) | Thermo Fisher Scientific | 41-1000 | |
CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (clone IM7), PE-Cy5 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A27094 | |
CD44 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging | Thermo Fisher Scientific | A25528 | |
CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (Clone IM7) | Thermo Fisher Scientific | RM-5700 (no longer available) | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | |
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11007 | |
Alkaline Phosphatase Live Stain | Thermo Fisher Scientific | A14353 | |
TRA-1-60 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging | Thermo Fisher Scientific | A25618 | |
CD24 Mouse Anti-Human mAb (clone SN3), FITC conjugate | Thermo Fisher Scientific | MHCD2401 | |
beta-2 Microglobulin Antibody, FITC conjugate (B2M-01) | Thermo Fisher Scientific | A15737 | |
EpCAM / CD326 Antibody, FITC conjugate (VU-1D9) | Thermo Fisher Scientific | A15755 | |
CD73 / NT5E Antibody (7G2) | Thermo Fisher Scientific | 41-0200 | |
VECTOR Red Alkaline Phosphatase (AP) Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-5100 | |
Zeiss Axio Observer.Z1 microscope | Carl Zeiss | 491912-0003-000 | |
FlowJo Data Analysis Software | FLOJO, LLC | N/A | |
Attune Accoustic Focusing Cytometer, Blue/Red Laser | Thermo Fisher Scientific | Use Attune NXT | |
S3e Cell Sorter (488/561 nm) | BIO-RAD | 1451006 | |
Falcon 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap | Corning | 352235 | |
Falcon 15 mL, high-clarity, dome-seal screw cap | Corning | 352097 | |
Falcon T-75 Flask | Corning | 353136 | |
Falcon T-175 Flask | Corning | 353112 | |
Falcon 6-well dish | Corning | 353046 | |
HERAEUS HERACELL CO2 ROLLING INCUBATOR | Thermo Fisher Scientific | 51013669 | |
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | AM12450 | ||
HulaMixer Sample Mixer | 15920D |