Cinética Medición y visualización en tiempo real de la reprogramación somática
Summary
El protocolo presentado en este estudio se describen métodos para la monitorización en tiempo real de la progresión de la reprogramación a través de la medición cinética de marcadores de células madre pluripotentes positivas y negativas utilizando citometría de flujo análisis. El protocolo también incluye la evaluación basada en la obtención de imágenes de la morfología y la expresión del indicador o marcador durante la generación de IPSC.
Abstract
Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease phenotypes. Recent advances have identified more efficient and safe methods for introduction of reprogramming factors. However, there are few tools to monitor and track the progression of reprogramming. Current methods for monitoring reprogramming rely on the qualitative inspection of morphology or staining with stem cell-specific dyes and antibodies. Tools to dissect the progression of iPSC generation can help better understand the process under different conditions from diverse cell sources.
This study presents key approaches for kinetic measurement of reprogramming progression using flow cytometry as well as real-time monitoring via imaging. To measure the kinetics of reprogramming, flow analysis was performed at discrete time points using antibodies against positive and negative pluripotent stem cell markers. The combination of real-time visualization and flow analysis enables the quantitative study of reprogramming at different stages and provides a more accurate comparison of different systems and methods. Real-time, image-based analysis was used for the continuous monitoring of fibroblasts as they are reprogrammed in a feeder-free medium system. The kinetics of colony formation was measured based on confluence in the phase contrast or fluorescence channels after staining with live alkaline phosphatase dye or antibodies against SSEA4 or TRA-1-60. The results indicated that measurement of confluence provides semi-quantitative metrics to monitor the progression of reprogramming.
Introduction
Las células madre pluripotentes inducidas derivados de los pacientes (iPSCs) son herramientas prometedoras para la terapia celular y la detección de drogas. Proporcionan una fuente autóloga de las células para la terapia. Además, abarcan un amplio conjunto de antecedentes genéticos, lo que permite un detallado análisis in vitro de enfermedades genéticas más allá de lo que las actuales líneas de células madre embrionarias (ESC) permitiría. Los avances recientes han conducido al desarrollo de varios métodos para la generación de iPSCs, incluyendo reprogramación con el virus Sendai, los plásmidos episomales o mRNAs 1,2. En particular, los diferentes métodos de reprogramación se asocian con diferentes niveles de eficiencia y seguridad, y es probable que difieran en otros aspectos que influyen en su idoneidad para diversas aplicaciones. Con la disponibilidad de una variedad de tecnologías de reprogramación, se ha convertido en importante desarrollar métodos para evaluar el proceso de reprogramación. La mayoría de los métodos existentes se basan en la inspección cualitativa de la morfología o la tincióncon colorantes y anticuerpos específicos de células madre. Un método recientemente desarrollado hace uso de la prensa de fluorescencia lentiviral que son sensibles a los miRNAs-PSC específico o ARNm específicos de células diferenciadas 3. Tales métodos de control facilitan la selección y optimización de técnicas de reprogramación para diferentes situaciones. Por ejemplo, CDy1 se ha utilizado como una sonda fluorescente para los primeros iPSCs con el fin de seleccionar moduladores de reprogramación 4. La capacidad de observar y comparar diferentes experimentos de reprogramación también es crítica para lograr una mejor comprensión del proceso en sí. Por ejemplo, ahora se sabe que algunos tipos de células somáticas son más fáciles de reprogramar que otros 5, y que las células pasan por estados intermedios durante la reprogramación 6-8. Desafortunadamente, los mecanismos que subyacen el proceso de reprogramación todavía no están completamente entendidos y en consecuencia, las diferencias exactas entre los métodos de reprogramación también quedan por defined. Por lo tanto, los métodos de supervisión, evaluación, y comparando los eventos de reprogramación siguen siendo crítico para el campo de células madre.
Los métodos descritos en este protocolo permiten el seguimiento y la evaluación del proceso de reprogramación e ilustran cómo estas técnicas se pueden utilizar para comparar diferentes conjuntos de reactivos de reprogramación. El primer enfoque implica la citometría de flujo se analiza usando combinaciones de anticuerpos contra (PSC) marcadores de células madre pluripotentes positivo y negativo. El segundo enfoque parejas en tiempo real de imágenes y la medición de la confluencia total (porcentaje de área de superficie cubierta por las células) y confluencia de señales de marcación (por ciento del área de superficie cubierta por las señales fluorescentes).
Protocol
Representative Results
Discussion
This study provides strategies for monitoring and tracking of the reprogramming process using flow cytometry and real-time imaging-based analysis. The critical steps in the protocol are initiating reprogramming, measuring reprogramming progression based on marker expression and real-time monitoring of reprogramming. Any reprogramming method of choice can be used but here we focus on Sendai based reprogramming of human fibroblasts. The advantage of this method is the ease of use and consistent high efficiency of reprogram…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Chad MacArthur útil para los debates.
Materials
| DMEM, high glucose, GlutaMAXSupplement, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 10569-010 | |
| Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified, US origin | Thermo Fisher Scientific | 16141-061 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | |
| Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts | Thermo Fisher Scientific | A24903 | |
| Attachment Factor Protein (1X) | Thermo Fisher Scientific | S-006-100 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 10565-018 | |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| Collagenase, Type IV, powder | Thermo Fisher Scientific | 17104-019 | |
| TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12563-011 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
| Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413302 | |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0264 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-020 | |
| Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | Thermo Fisher Scientific | 15260-037 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| InSolution Y-27632 | EMD Millipore | 688001 | |
| CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A1378001 | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A16517 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| BJ ATCC Human Foreskin Fibroblasts, Neonatal | ATCC | CRL-2522 | |
| DF1 Adult Human Dermal Fibroblast | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| BG01V/hOG Cells Variant hESC hOct4-GFP Reporter Cells | Thermo Fisher Scientific | R7799-105 | |
| IncuCyte ZOOM | Essen BioScience | ||
| SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate (MC813-70) | Thermo Fisher Scientific | SSEA421 | |
| SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (eBioMC-813-70 (MC-813-70)) | Thermo Fisher Scientific | A14810 | |
| SSEA-4 Antibody (MC813-70) | Thermo Fisher Scientific | 41-4000 | |
| TRA-1-60 Antibody (cl.A) | Thermo Fisher Scientific | 41-1000 | |
| CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (clone IM7), PE-Cy5 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A27094 | |
| CD44 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging | Thermo Fisher Scientific | A25528 | |
| CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (Clone IM7) | Thermo Fisher Scientific | RM-5700 (no longer available) | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11007 | |
| Alkaline Phosphatase Live Stain | Thermo Fisher Scientific | A14353 | |
| TRA-1-60 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging | Thermo Fisher Scientific | A25618 | |
| CD24 Mouse Anti-Human mAb (clone SN3), FITC conjugate | Thermo Fisher Scientific | MHCD2401 | |
| beta-2 Microglobulin Antibody, FITC conjugate (B2M-01) | Thermo Fisher Scientific | A15737 | |
| EpCAM / CD326 Antibody, FITC conjugate (VU-1D9) | Thermo Fisher Scientific | A15755 | |
| CD73 / NT5E Antibody (7G2) | Thermo Fisher Scientific | 41-0200 | |
| VECTOR Red Alkaline Phosphatase (AP) Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-5100 | |
| Zeiss Axio Observer.Z1 microscope | Carl Zeiss | 491912-0003-000 | |
| FlowJo Data Analysis Software | FLOJO, LLC | N/A | |
| Attune Accoustic Focusing Cytometer, Blue/Red Laser | Thermo Fisher Scientific | Use Attune NXT | |
| S3e Cell Sorter (488/561 nm) | BIO-RAD | 1451006 | |
| Falcon 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap | Corning | 352235 | |
| Falcon 15 mL, high-clarity, dome-seal screw cap | Corning | 352097 | |
| Falcon T-75 Flask | Corning | 353136 | |
| Falcon T-175 Flask | Corning | 353112 | |
| Falcon 6-well dish | Corning | 353046 | |
| HERAEUS HERACELL CO2 ROLLING INCUBATOR | Thermo Fisher Scientific | 51013669 | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | AM12450 | ||
| HulaMixer Sample Mixer | 15920D |
Riferimenti
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