Trasduzione retrovirale di cellule progenitrici del midollo osseo per generare cellule T del recettore Retrogenic Mice
Summary
We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.
Abstract
T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCRα and TCRβ chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.
Introduction
Recettore delle cellule T (TCR) repertorio di esseri umani e topi è stato stimato a 1 x 10 8 e 2 x 10 6 TCR unici rispettivamente 1,2. Questa grande diversità permette cellule T di riconoscere una vasta gamma di epitopi antigenici derivati da auto-peptidi e da agenti patogeni presentati dal complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) sulle cellule presentanti l'antigene (APC). Le sottili differenze nelle interazioni dei TCR con unici complessi peptide-MHC determinano se una cellula T subirà apoptosi, anergia, l'attivazione, la differenziazione, la produzione di citochine e citotossicità. Tuttavia, a causa della grande repertorio TCR, analisi di come una determinata TCR risponderà a un particolare antigene richiede l'utilizzo di sistemi singoli TCR.
Vari topi transgenici TCR sono state generate per studiare la funzione di un singolo TCR in un modello in vivo 3-9. Tuttavia, ci sono avvertimenti di TCR topi transgenici compresa lacosto, la lunghezza di tempo per generare un singolo topo transgenico e il cosiddetto effetto fondatore di inserimento transgene casuale nel DNA germinale 10. Pertanto, relativamente pochi topi transgenici TCR sono stati generati per un dato antigene e le implicazioni funzionali di alta e bassa affinità TCR per lo stesso epitopo sono raramente affrontati. Per affrontare la necessità di un avvicinamento rapido alla schermata e studiare più TCR singolarmente o in combinazione, topi retrogenic ( 'retro' da retrovirus e 'geniche' dal transgenici) sono stati utilizzati come alternativa al TCR topi transgenici 11-13.
Il motivo di consenso 2A peptide trovato all'interno di diversi virus sono costituiti da un 2A-Asp-Val / Ile-Glut-X-Asn-Pro-Gly-2B-Pro, in cui scissione avviene tra la glicina del 2A e prolina del 2B da cis -acting attività idrolasi, con conseguente salto ribosomiale durante la traduzione 10,14-16. Per uno schema dettagliato raffigurante la cleavage dei vari peptidi 2A (F2A, E2A, T2A e P2A) consultare i riferimenti 10 – 12. In questo modo, 2 cistroni (TCR alfa e beta TCR) possono essere collegati con conseguente traduzione stechiometrica in un singolo vettore. Utilizzando questo approccio, siamo in grado di esprimere e confrontare direttamente più TCR specifici antigeni in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nel protocollo, abbiamo dettaglio diversi passaggi critici per garantire la salute del midollo osseo ottimale, l'efficienza di trasduzione e la ricostituzione. Il primo passo fondamentale è la generazione e la corretta manutenzione delle cellule produttrici virale GP + E86. Utilizzare linee cellulari produttori di passaggio precoce e mantenere a 80% di confluenza o inferiore prima dell'uso. Quando si effettuano fresche cellule produttrici virale GP + E86, garantire le cellule 293T sono di passaggio precoce e in…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal NIH (5K22A1119151-01 e 1R56DK104903-01) per MLB, Pilot / fattibilità del programma del Diabetes Research Center (P30-DK079638) al BCM, JDRF 1-FAC-2014-243-AN APF, ADA 1-15-JF-07, Carriere AAI in Immunologia Fellowship a MB, e The Robert e Janice McNair Fondazione.
Materials
| DMEM, high glucose + glutamine | Corning Cellgro | 10-013-CV | Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| Trypsin-Versene | Lonza | 17-161F | |
| 0.45 um syringe filter | Thermo Scientific | 194-2545 | |
| polybrene | Sigma | H9268-10G | Sterile Filtered in dH2O |
| Ciprofloxacin | VWR | AAJ61970-06 | |
| 5-fluorouracil (5-FU) | VWR | AAA13456-06 | |
| Sodium Pyruvate | Corning Cellgro | 25-000-CI | |
| MEM nonessential Amino Acids | Corning Cellgro | 25-025-CI | |
| HEPES 1M solution | Corning Cellgro | 25-060-CI | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco by Life Technologies | 21985-023 | |
| Pen/Strept | Corning Cellgro | 30-002-CI | |
| L-glutamine | Corning Cellgro | 25-005-CI | |
| 150 mm tissue culture dishes | Greiner Bio-one | 639160 | |
| Tisue culture-treated 6-well flat plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| 70 um nylon cell strainers | Falcon | 352350 | |
| Mouse IL-3 | Invitrogen | PMC0033 | |
| Human IL-6 | Invitrogen | PHC0063 | |
| Mouse Stem Cell Factor | Invitrogen | PMC2113L | |
| 10x PBS | Corning Cellgro | 46-D13-CM | |
| HANKS Buffer | Corning Cellgro | 21020147 | |
| BD 10 mL Syringe | BD | 300912 | |
| BD 1 mL Syringe | BD | 309659 | |
| 27G x 1/2 BD Precision Glide Needle | BD | 305109 | |
| 30G x 1/2 BD Precision Glide Needle | BD | 305106 |
Riferimenti
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