مجمع متضاعف الكتروليتي للهيبارين ربط تسليم عظمية عامل نمو المجال
Summary
Self-assembled polyelectrolyte complexes (PEC) fabricated from heparin and protamine were deposited on alginate beads to entrap and regulate the release of osteogenic growth factors. This delivery strategy enables a 20-fold reduction of BMP-2 dose in spinal fusion applications. This article illustrates the benefits and fabrication of PECs.
Abstract
أثناء العمليات الجراحية الترميمية العظام، يتم تحميل كميات supraphysiological من عوامل النمو تجريبيا على السقالات لتعزيز نجاح الاندماج العظمي. مطلوبة جرعات كبيرة من العوامل البيولوجية قوية للغاية نظرا لعامل النمو عدم الاستقرار نتيجة لتدهور الأنزيمية السريع وكذلك عدم الكفاءة الناقل في توطين كميات كافية من عامل النمو في مواقع الزرع. وبالتالي، يمكن أن الاستراتيجيات التي تطيل استقرار عوامل النمو مثل BMP-2 / NELL-1، والسيطرة على الإفراج عنهم بالفعل خفض الجرعة الفعالة، وبالتالي تقلل من الحاجة إلى جرعات أكبر أثناء العمليات الجراحية تجديد العظام في المستقبل. وهذا بدوره سوف يقلل الآثار الجانبية وتكاليف عامل النمو. تم ملفقة المتوقَّع (PECs) الذاتي تجميعها لتوفير تحكم أفضل من BMP-2 / NELL-1 التسليم عن طريق الهيبارين ملزمة وتحقيق المزيد من النمو تحفيز عامل النشاط الحيوي من خلال تعزيز الاستقرار في الجسم الحي. نحن هنا توضيح بساطة PEC تلفيق الذي يساعد في deliveراي لمجموعة متنوعة من عوامل النمو خلال عملية جراحية العظام الترميمية.
Introduction
وقد تم الإبلاغ عن حدوث فصال كاذب إلى أن تصل إلى 10-45٪ في الانصهار في العمود الفقري التنكسية ومراجعة عملية جراحية في العمود الفقري 1. للحد من معدل المفصل الموهم خلال انصهار العمود الفقري وغيرها من العمليات الجراحية الترميمية العظام، أدخلت عوامل النمو المكونة للعظم مثل BMP-2، نيل-1 1 وصفائح المستمدة عامل النمو (PDGF) لتعزيز دي نوفو تكون العظم. ومن بين هؤلاء، BMP-2 هو خيار شعبي لدمج الفقرات 2. على الرغم من أن قوة من BMP-2 في تحريض وتسهيل تكوين العظام الجديدة قد تم راسخة 3؛ لا تزال مضاعفات هامة سريريا مثل تشكيل منتبذ العظام، تورم مصلي وتشكيل ورم دموي، والاستجابة الالتهابية، التهاب الجذر، الفقري عظام النهايات الجسم، والقذف إلى الوراء لتكون من القضايا ذات الاهتمام نظرا لكميات supraphysiological المستخدمة 4،5.
لذلك، وتخفيض جرعة من BMP-2 لا يزال يمثل استراتيجية ذات الصلة في فييغري للحد من الآثار الجانبية. الى جانب ذلك، ثمة حاجة لأنظمة الناقل فعالة لقمع إطلاق سراح دفعة الأولي من BMP-2 التي لوحظت في أنظمة الإسفنج الناقل الكولاجين المعاصر وتعزيز تسليم لفترات طويلة والمترجمة من هذا خلوى قوية. طبقة تلو طبقة التجميع الذاتي للبالتناوب polyelectrolytes الموجبة والأيونية يمكن استخدامها كوسيلة من وسائل الانضباطي لبناء المجمعات متضاعف الكتروليتي على سطح المصفوفات سقالة أو المواد القابلة للزرع 6. في هذا الصدد، وقد اعترف الهيبارين (المعروف لديها أعلى كثافة الشحنة السلبية من كل العوامل البيولوجية) لربط بشوق مع مجموعة متنوعة من عوامل النمو عبر المجالات الكهروستاتيكية والهيبارين ملزمة. في الواقع، وقد تبين الهيبارين لإطالة عمر النصف، وبالتالي تحفيز النشاط الحيوي لعدة عوامل النمو.
وبناء على هذا، تتكيف مجموعتنا بروتوكول التجميع الذاتي طبقة تلو طبقة اختلاق مجمع متضاعف الكتروليتي القائم على الهيبارين (PEC) أن الأحمال ويحافظ على bioactivities من عوامل النمو المكونة للعظم خلال تجميد 7،8. كانت ملفقة جوهر ميكروبيدات الجينات التي يشابك بقايا من الجينات مع ثنائي التكافؤ الموجبة الكالسيوم أو السترونتيوم أيونات α-L-guluronate (G). جوهر الجينات هو سقالة المصفوفة القابلة للتحلل. وبعد الزرع، هو resorbed في السرير الانصهار توفير غرفة لنشوب عظمي. يستخدم بولي-L-ليسين (PLL) أو بروتامين كطبقة الموجبة تشبيك مع كل من مصفوفة سقالة (في هذه الحالة، جوهر الجينات ميكروبيدات الناقل) والهيبارين سالبة الشحنة. في حين أن وظائف طبقة الهيبارين الأيونية لتحقيق الاستقرار وتوطين عوامل النمو تحميلها. وقد تبين طبقة ثلاثية PEC لزيادة قدرة التحميل عامل النمو في نموذج الخنازير 9. في الآونة الأخيرة، وقد ثبت ناقلات PEC للحد بنجاح الجرعة الفعالة للBMP-2 بنسبة لا تقل عن 20 ضعفا في الفئران (10) ونماذج الخنازير لدمج الفقرات 8.
ntent "> هنا، ونحن التقرير أساليب افتعال المتوقَّع (PECs) لتعزيز النمو تسليم عامل في الانصهار في العمود الفقري وغيرها من العمليات الجراحية الترميمية العظام باستخدام BMP-2 كعامل نمو المكونة للعظم نموذج.Protocol
Representative Results
Discussion
ويعرض هذا البروتوكول طريقة لإعداد بيكس من خلال طبقة تلو طبقة التجميع الذاتي. هو تصور بنية طبقة تلو طبقة باستخدام نظائرها الفلورسنت من بروتامين، الهيبارين، BMP-2 و NELL-1 و متحد البؤر المجهري. امتصاص وإطلاق سراح الاختبارات تظهر أن الهيبارين على PEC يتوسط عظمي المنشأ امتصاص …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
These studies were funded by National Medical Research Council Clinician Scientist – Individual Research Grant (CS-IRG) NMRC/CIRG/1372/2013 and NMRC EDG/0022/2008.
Materials
| Life Science Acrodisc 25mm Syring Filter w/0.2 µm Supor Membrane | PALL | PN4612 | Sterile protamine, heparin solution by ultrafiltration |
| 24 well plate | Cell Star | 662160 | |
| 96 well plate Nuclon Delta Surface | Thermo Fisher Scientific | 167008 | |
| (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide), MTT | Sigma Aldrich | M5655 | Measure cytotoxicity of PEC-NELL-1 |
| Acetone | Fisher Scientific | A/0600/17 | Precipitate CF-405 Labelled protamine |
| Alamar Blue | Invitrogen, Life Technologies | DAL 1025 | Measure cytotoxicity of PEC-BMP-2 |
| Alkaline Phosphatase Assay (ALP) assay kit | Anaspec | AS-72146 | |
| Ammonium Chloride | Merck | Art 1145 | Stop reagent in FITC labelling |
| Anhydrous Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Invitrogen, Life Technologies | D12345 | Solvent for fluorescent isothiocyanate I |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | Dissolve formazan | |
| Autoclave | Hirayama | HU-110 | Sterilize alginate beads by steam |
| Beta-glycerophosphate | Sigma Aldrich | G9422 | |
| BMP-2 (Infuse Bone Graft Large II Kit) | Medtronic Sofarmor Danek, Memphis TN, USA | 7510800 | Osteogenic Growth Factor, dialysis is needed to remove stabilizer component that interferes with FITC coupling |
| Carboxybenzoyl quinoline-2-Carboxaldehyde (CBQCA) | Thermo Fisher Scientific | A-6222 | To quantify NELL-1 protein |
| Cell Strainer (100µm) | BD Science | 352360 | Hold PEC for ALP assay |
| Cell Scraper 290mm Bladewide 20mm | SPL Life Science | 90030 | Detach the cell from 24 well plate |
| CF 405S, Succinimidyl Ester | Sigma Aldrich | SCJ4600013 | Blue fluorescent dye for protamine labelling |
| CF 594, Hydrazide | Sigma Aldrich | SCJ4600031 | Deep red fluorescent dye for heparin labelling |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | Component of osteogenic growth medium |
| Dextran Desalting Columns | Pierce (Thermo Scientific) | 43230 | |
| DMEM | Gibco | 12320 | |
| BMP-2 Quantikine ELISA Kit | R&D System | DBP200 | Determine BMP-2 release |
| Fetal Bovine Serum FBS | Hyclone | SV30160.03 | |
| Fluoescein Isothiocyananate, Isomer I | Sigma Aldrich | F7250 | Green fluorescent dye for NELL-1 and BMP-2 labelling |
| ThinCert Cell Culture Inserts, For 24 Well plates, Sterile |
Greiner | 662630 | Prevents PEC wash out when changing osteogenic medium |
| Havard Appartus Syringe Pump (11 plus) | Havard Apparatus | 70-2208 | |
| n-Hexane (>99%) | Sigma Aldrich | 139386 | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149 | Binds with osteogenic growth factor with heparin binding domain |
| Hydrochloric acid (37%) | Merck | 100317 | Highly Corrosive |
| Incubator | Binder | C8150 | |
| MicroBCA Protein Assay kit | Thermoscientific | 23235 | |
| Microplate Reader | Tecan | Infinite M200 | For ALP and microBCA assays |
| NELL-1 | Aragen Bioscience Morgan Hill, CA, USA | N/A | Osteogenic growth factor, keep at -80˚C |
| Nisco cell encapsulator | Nisco Engineering Inc | Encapsulation unit VAR V1 | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | IX71 | |
| mPCL-TCP Scaffold (Pore size is 1.3mm) | Osteopore | PCL-TCP 0/90 | Hold PEC for in vivo study |
| Penicillin-Streptomycin 10,000 unit/ml, 100ml | Hyclone Cell Culture | SV30010 | Antibiotic |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | Vivantis | PB0344-1L | 10x Solution, Ultra Pure Grade |
| Poly-L-Lysine MW 15,000-30,000 | Sigma Aldrich | P2568 | Polycation |
| Protamine Sulfate salt, from Salmon | Sigma Aldrich | P4020 | Polycation |
| Shaker | Labnet | S2025 | |
| Snakeskin Dialysis Tubing 3,500 MWCO 22mm x 35 feet | Thermo Fisher Scientific | 68035 | Remove unreacted FITC by dialysis |
| Sodium Chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
| Sodium Hydroxide | Qrec | S5158 | |
| Sodium Bicarbonate | US Biological | S4000 | Buffer |
| Sodium carbonate | Sigma Aldrich | S7795-500G | Buffer |
| Strontium Chloride Hexahydrate | Sigma Aldrich | 255521 | Crosslinker for alginate |
| Spatula | 3dia | ||
| 5ml syringe | Terumo | 140425R | Diameter of syringe affects the flow rate |
| 75cm2 Cell Culture Flask Canted Neck | Corning | 730720 | |
| Toluidine Blue | Sigma Aldrich | 52040 | Heparin assay |
| Trypsin 1X | Hyclone Cell Culture | SH30042.01 | |
| Sodium alginate | Novamatrix (FMC Biopolymer, Princeton, NJ) | Pronova UPMVG | Core material of microbeads |
Riferimenti
- Yuan, W., et al. NELL-1 based demineralized bone graft promotes rat spine fusion as compared to commercially available BMP-2 product. Orthop Sci. 18, 646-657 (2013).
- Anderson, C. L., Whitaker, M. C. Heterotopic ossification associated with recombinant human bone morphogenetic protein-2 (infuse) in posterolateral lumbar spine fusion: a case report. Spine. 37, 502-506 (2012).
- Glassman, S. D., et al. RhBMP-2 versus iliac crest bone graft for lumbar spine fusion: a randomized, controlled trial in patients over sixty years of age. Spine. 33, 2843-2849 (2008).
- Tannoury, C. A., An, H. S. Complications with the use of bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) in spine surgery. Spine J. 14, 552-559 (2014).
- Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned. Spine J. 11, 471-491 (2011).
- Abbah, S. A., Lam, C. X., Hutmacher, D. W., Goh, J. C., Wong, H. K. Biological performance of a polycaprolactone-based scaffold used as fusion cage device in a large animal model of spinal reconstructive surgery. Biomaterials. 30, 5086-5093 (2009).
- Abbah, S. A., Liu, J., Lam, R. W., Goh, J. C., Wong, H. K. In vivo bioactivity of rhBMP-2 delivered with novel polyelectrolyte complexation shells assembled on an alginate microbead core template. J. Control. Release. 162, 364-372 (2012).
- Wang, M., et al. Polyelectrolyte Complex Carrier Enhances Therapeutic Efficiency and Safety Profile of Bone Morphogenetic Protein-2 in Porcine Lumbar Interbody Fusion Model. Spine. 40, 964-973 (2015).
- Abbah, S. A., Lam, W. M., Hu, T., Goh, J., Wong, H. K. Sequestration of rhBMP-2 into self-assembled polyelectrolyte complexes promotes anatomic localization of new bone in a porcine model of spinal reconstructive surgery. Tissue Eng. Part A. 20, 1679-1688 (2014).
- Hu, T., et al. Novel Protamine-Based Polyelectrolyte Carrier Enhances Low-Dose rhBMP-2 in Posterolateral Spinal Fusion. Spine. 40, 613-621 (2015).
- Hu, J., Hou, Y., Park, H., Lee, M. Beta-tricalcium phosphate particles as a controlled release carrier of osteogenic proteins for bone tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 100, 1680-1686 (2012).
- Darrabie, M. D., Kendall, W. F., Opara, E. C. Characteristics of Poly-L-Ornithine-coated alginate microcapsules. Biomaterials. 26, 6846-6852 (2005).
- Li, X., Min, S., Zhao, X., Lu, Z., Jin, A. Optimization of entrapping conditions to improve the release of BMP-2 from PELA carriers by response surface methodology. Biomed Mater. 10, 015002 (2015).
