के लिए हेपरिन बाध्यकारी डोमेन osteogenic विकास फैक्टर प्रसव Polyelectrolyte परिसर
Summary
Self-assembled polyelectrolyte complexes (PEC) fabricated from heparin and protamine were deposited on alginate beads to entrap and regulate the release of osteogenic growth factors. This delivery strategy enables a 20-fold reduction of BMP-2 dose in spinal fusion applications. This article illustrates the benefits and fabrication of PECs.
Abstract
पुनर्निर्माण की हड्डी की सर्जरी के दौरान वृद्धि कारकों की supraphysiological मात्रा में अनुभव से मचानों पर लोड कर रहे सफल हड्डी संलयन बढ़ावा देने के लिए। अत्यधिक शक्तिशाली जैविक एजेंटों की बड़ी खुराक तेजी से enzymatic गिरावट का एक परिणाम के रूप में वृद्धि कारक अस्थिरता के साथ ही प्रत्यारोपण स्थलों पर विकास का पहलू की पर्याप्त मात्रा में स्थानीयकृत करने में वाहक अक्षमताओं के कारण आवश्यक हैं। इसलिए, रणनीति है कि इस तरह के बीएमपी -2 / नेल-1 के रूप में वृद्धि कारकों की स्थिरता लम्बा, और उनकी रिहाई पर नियंत्रण वास्तव में उनके प्रभावशाली खुराक को कम कर सकता है और इस तरह भविष्य हड्डी पुनर्जनन सर्जरी के दौरान बड़ी मात्रा की आवश्यकता को कम। बदले में यह दुष्प्रभाव और वृद्धि कारक लागत कम हो जाएगा। आत्म इकट्ठे पेक्स में विवो स्थिरता को बढ़ाने के द्वारा हेपरिन बंधन और आगे शक्ति प्रदान वृद्धि कारक bioactivity के माध्यम से बीएमपी -2 / नेल-1 प्रसव के बेहतर नियंत्रण प्रदान करने के लिए निर्मित किया गया है। यहाँ हम पीईसी निर्माण की सादगी जो delive में एड्स को समझानापुनर्निर्माण की हड्डी की सर्जरी के दौरान विकास के कारकों की एक किस्म की ry।
Introduction
Pseudoarthrosis की घटनाओं अपक्षयी रीढ़ की हड्डी में फ्यूजन और संशोधन स्पाइनल सर्जरी 1 में 10 से 45% के रूप में उच्च के रूप में होने की सूचना दी गई है। रीढ़ संलयन और अन्य पुनर्निर्माण की हड्डी की सर्जरी, ऐसे बीएमपी -2, नेल-1 1 और प्लेटलेट व्युत्पन्न वृद्धि कारक (PDGF) के रूप में osteogenic वृद्धि कारक नए सिरे से osteogenesis बढ़ावा देने के लिए शुरू किया गया है के दौरान Pseudarthrosis की दर को कम करने के लिए। इन के अलावा, बीएमपी -2 स्पाइनल फ्यूजन 2 के लिए एक शानदार विकल्प है। हालांकि उत्प्रेरण और नई हड्डी गठन को सुविधाजनक बनाने में बीएमपी -2 की शक्ति अच्छी तरह से 3 स्थापित किया गया है; ऐसे Heterotopic हड्डी गठन, seroma और रक्तार्बुद, भड़काऊ प्रतिक्रिया, radiculitis, कशेरुका शरीर osteolysis, और प्रतिगामी स्खलन के रूप में चिकित्सकीय महत्वपूर्ण जटिलताओं supraphysiological 4,5 इस्तेमाल किया मात्रा के कारण चिंता के मुद्दों होना जारी है।
इसलिए, बीएमपी -2 की खुराक कम से कम में एक प्रासंगिक रणनीति बनी हुई हैदुष्प्रभाव को कम करने के लिए tempts। इसके अलावा, कुशल वाहक सिस्टम बीएमपी -2 समकालीन कोलेजन स्पंज वाहक प्रणालियों में मनाया की प्रारंभिक फट रिहाई को दबाने और आगे इस शक्तिशाली साइटोकाइन के लंबे समय तक और स्थानीय प्रसव को बढ़ाने के लिए आवश्यक हैं। परत दर परत cationic और ऋणात्मक polyelectrolytes बारी की आत्म विधानसभा पाड़ matrices या प्रत्यारोपण सामग्री 6 की सतह पर polyelectrolyte परिसरों का निर्माण करने के लिए एक ट्यून करने योग्य पद्धति के रूप में नियोजित किया जा सकता है। इस संबंध में, हेपरिन (सभी जैविक एजेंटों के उच्चतम नकारात्मक चार्ज घनत्व होने के लिए जाना जाता है) उत्सुकतापूर्वक इलेक्ट्रोस्टैटिक और हेपरिन बाध्यकारी डोमेन के माध्यम से विकास के कारकों की एक किस्म के साथ बाँध के लिए मान्यता दी गई है। दरअसल, हेपरिन आधा जीवन को लम्बा और इस तरह कई वृद्धि कारकों की bioactivity शक्ति प्रदान करने के लिए दिखाया गया है।
इस के आधार पर, हमारे समूह एक हेपरिन आधारित polyelectrolyte जटिल (पीईसी) है कि निर्माण करने के लिए एक परत दर परत आत्म विधानसभा प्रोटोकॉल अनुकूलित भार और स्थिरीकरण 7.8 दौरान osteogenic वृद्धि कारकों की bioactivities बरकरार रखता है। alginate microbead कोर α एल guluronate (G) द्विसंयोजक केशन कैल्शियम या स्ट्रोंटियम आयनों के साथ alginate के अवशेषों crosslinking द्वारा निर्मित किया गया था। alginate कोर एक biodegradable पाड़ मैट्रिक्स है; जो आरोपण के बाद, यह संलयन बिस्तर बोनी अंतर्वृद्धि के लिए कमरे उपलब्ध कराने में resorbed है। पाली एल लाइसिन (पीएलएल) या protamine cationic परत दोनों पाड़ मैट्रिक्स (इस मामले में, alginate microbead वाहक कोर) और नकारात्मक आरोप लगाया हेपरिन के साथ जिल्द के रूप में प्रयोग किया जाता है; ऋणात्मक हेपरिन परत कार्यों को स्थिर और भरी हुई वृद्धि कारक स्थानीय बनाना है। ट्रिपल परत पीईसी एक सुअर का मॉडल 9 में वृद्धि कारक लदान क्षमता बढ़ाने के लिए दिखाया गया है। हाल ही में, पीईसी वाहक सफलतापूर्वक चूहा 10 और रीढ़ की हड्डी में फ्यूजन 8 की सुअर का मॉडल में कम से कम 20 गुना से बीएमपी -2 के प्रभावी खुराक को कम करने के लिए दिखाया गया है।
ntent "> यहाँ, हम रीढ़ की हड्डी में फ्यूजन में बढ़ाया वृद्धि कारक वितरण और अन्य पुनर्निर्माण की हड्डी की सर्जरी के लिए fabricating पेक्स के तरीकों के लिए एक मॉडल osteogenic विकास कारक के रूप में बीएमपी -2 का उपयोग कर रिपोर्ट।Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल परत दर परत आत्म विधानसभा के माध्यम से पेक्स की तैयारी के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। परत दर परत संरचना protamine, हेपरिन, बीएमपी -2 और नेल -1 और confocal माइक्रोस्कोपी के फ्लोरोसेंट analogues का उपयोग करते हु…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
These studies were funded by National Medical Research Council Clinician Scientist – Individual Research Grant (CS-IRG) NMRC/CIRG/1372/2013 and NMRC EDG/0022/2008.
Materials
| Life Science Acrodisc 25mm Syring Filter w/0.2 µm Supor Membrane | PALL | PN4612 | Sterile protamine, heparin solution by ultrafiltration |
| 24 well plate | Cell Star | 662160 | |
| 96 well plate Nuclon Delta Surface | Thermo Fisher Scientific | 167008 | |
| (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide), MTT | Sigma Aldrich | M5655 | Measure cytotoxicity of PEC-NELL-1 |
| Acetone | Fisher Scientific | A/0600/17 | Precipitate CF-405 Labelled protamine |
| Alamar Blue | Invitrogen, Life Technologies | DAL 1025 | Measure cytotoxicity of PEC-BMP-2 |
| Alkaline Phosphatase Assay (ALP) assay kit | Anaspec | AS-72146 | |
| Ammonium Chloride | Merck | Art 1145 | Stop reagent in FITC labelling |
| Anhydrous Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Invitrogen, Life Technologies | D12345 | Solvent for fluorescent isothiocyanate I |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | Dissolve formazan | |
| Autoclave | Hirayama | HU-110 | Sterilize alginate beads by steam |
| Beta-glycerophosphate | Sigma Aldrich | G9422 | |
| BMP-2 (Infuse Bone Graft Large II Kit) | Medtronic Sofarmor Danek, Memphis TN, USA | 7510800 | Osteogenic Growth Factor, dialysis is needed to remove stabilizer component that interferes with FITC coupling |
| Carboxybenzoyl quinoline-2-Carboxaldehyde (CBQCA) | Thermo Fisher Scientific | A-6222 | To quantify NELL-1 protein |
| Cell Strainer (100µm) | BD Science | 352360 | Hold PEC for ALP assay |
| Cell Scraper 290mm Bladewide 20mm | SPL Life Science | 90030 | Detach the cell from 24 well plate |
| CF 405S, Succinimidyl Ester | Sigma Aldrich | SCJ4600013 | Blue fluorescent dye for protamine labelling |
| CF 594, Hydrazide | Sigma Aldrich | SCJ4600031 | Deep red fluorescent dye for heparin labelling |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | Component of osteogenic growth medium |
| Dextran Desalting Columns | Pierce (Thermo Scientific) | 43230 | |
| DMEM | Gibco | 12320 | |
| BMP-2 Quantikine ELISA Kit | R&D System | DBP200 | Determine BMP-2 release |
| Fetal Bovine Serum FBS | Hyclone | SV30160.03 | |
| Fluoescein Isothiocyananate, Isomer I | Sigma Aldrich | F7250 | Green fluorescent dye for NELL-1 and BMP-2 labelling |
| ThinCert Cell Culture Inserts, For 24 Well plates, Sterile |
Greiner | 662630 | Prevents PEC wash out when changing osteogenic medium |
| Havard Appartus Syringe Pump (11 plus) | Havard Apparatus | 70-2208 | |
| n-Hexane (>99%) | Sigma Aldrich | 139386 | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149 | Binds with osteogenic growth factor with heparin binding domain |
| Hydrochloric acid (37%) | Merck | 100317 | Highly Corrosive |
| Incubator | Binder | C8150 | |
| MicroBCA Protein Assay kit | Thermoscientific | 23235 | |
| Microplate Reader | Tecan | Infinite M200 | For ALP and microBCA assays |
| NELL-1 | Aragen Bioscience Morgan Hill, CA, USA | N/A | Osteogenic growth factor, keep at -80˚C |
| Nisco cell encapsulator | Nisco Engineering Inc | Encapsulation unit VAR V1 | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | IX71 | |
| mPCL-TCP Scaffold (Pore size is 1.3mm) | Osteopore | PCL-TCP 0/90 | Hold PEC for in vivo study |
| Penicillin-Streptomycin 10,000 unit/ml, 100ml | Hyclone Cell Culture | SV30010 | Antibiotic |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | Vivantis | PB0344-1L | 10x Solution, Ultra Pure Grade |
| Poly-L-Lysine MW 15,000-30,000 | Sigma Aldrich | P2568 | Polycation |
| Protamine Sulfate salt, from Salmon | Sigma Aldrich | P4020 | Polycation |
| Shaker | Labnet | S2025 | |
| Snakeskin Dialysis Tubing 3,500 MWCO 22mm x 35 feet | Thermo Fisher Scientific | 68035 | Remove unreacted FITC by dialysis |
| Sodium Chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
| Sodium Hydroxide | Qrec | S5158 | |
| Sodium Bicarbonate | US Biological | S4000 | Buffer |
| Sodium carbonate | Sigma Aldrich | S7795-500G | Buffer |
| Strontium Chloride Hexahydrate | Sigma Aldrich | 255521 | Crosslinker for alginate |
| Spatula | 3dia | ||
| 5ml syringe | Terumo | 140425R | Diameter of syringe affects the flow rate |
| 75cm2 Cell Culture Flask Canted Neck | Corning | 730720 | |
| Toluidine Blue | Sigma Aldrich | 52040 | Heparin assay |
| Trypsin 1X | Hyclone Cell Culture | SH30042.01 | |
| Sodium alginate | Novamatrix (FMC Biopolymer, Princeton, NJ) | Pronova UPMVG | Core material of microbeads |
Riferimenti
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