Self-assembled polyelectrolyte complexes (PEC) fabricated from heparin and protamine were deposited on alginate beads to entrap and regulate the release of osteogenic growth factors. This delivery strategy enables a 20-fold reduction of BMP-2 dose in spinal fusion applications. This article illustrates the benefits and fabrication of PECs.
再建骨手術中に、成長因子の超生理学的な量は、経験的に成功した骨の融合を促進するために足場上に装填されています。非常に強力な生物剤の大量投与は、急速な酵素分解の結果としての成長因子の不安定性だけでなく、移植部位で成長因子の十分な量をローカライズにおけるキャリアの非効率性に必要とされます。したがって、例えばBMP-2 / NELL-1のような成長因子の安定性を延長戦略、及びそれらの放出を制御するには、実際に有効な投与量を低下させ、従って、将来の骨再生手術の間に、より大きな用量の必要性を減らすことができます。これにより、副作用および成長因子コストを削減します。自己集合のPECは、 インビボでの安定性を高めることにより、ヘパリン結合、さらに増強成長因子の生物活性を介して、BMP-2 / NELL-1送達の良好な制御を提供するために製造されています。ここでは、deliveに役立つPEC製造の単純さを示しています再建骨の手術中に種々の成長因子のRY。
偽の発生率は、変性脊椎固定術およびリビジョン脊椎手術1の10〜45%と高いことが報告されています。脊椎融合および他の再建骨手術中に偽関節の速度を減少させるために、例えば、BMP-2、NELL-1および血小板由来増殖因子(PDGF)などの骨形成増殖因子はデノボ骨形成を促進するために導入されています。これらのうち、BMP-2は、脊椎固定術2のための一般的な選択です。新骨形成を誘導および促進におけるBMP-2の効力は十分に3を確立してきたが。このような異骨形成、血清腫および血腫形成、炎症反応、神経根炎、椎体の骨溶解、および逆行性射精などの臨床的に有意な合併症が原因で4,5使用超生理学的量に関心事項であり続けます。
したがって、BMP-2の用量を低下させることがでに関連する戦略まま副作用を最小にするために誘惑。また、効率的なキャリアシステムは、現代のコラーゲンスポンジ担体系で観察されたBMP-2の初期バースト放出を抑制し、さらに、この強力なサイトカインの長期化と局所的な送達を促進するために必要とされます。陽イオンおよび陰イオン高分子電解質の交互の層毎の自己集合足場マトリックスまたは移植可能な材料6の表面に高分子電解質複合体を構築するための調整可能な方法として使用することができます。この点では、(すべての生物学的因子の最も負の電荷密度を有するために知られている)、ヘパリンが強く静電及びヘパリン結合ドメインを介して、種々の増殖因子と結合することが認識されています。実際、ヘパリンは半減期を延長し、従って、いくつかの成長因子の生物活性を増強することが示されています。
これに基づいて、私たちのグループは、ヘパリン系高分子電解質複合体(PEC)を製造するために層ごとの自己集合のプロトコルを適合その負荷および固定化7,8の間に骨形成成長因子の生物活性を保持します。アルギン酸マイクロビーズのコアは、二価カチオン、カルシウムまたはストロンチウムイオンと、アルギン酸塩のα-L-グルロン酸(G)残基を架橋することによって作製しました。アルギン酸コアは、生分解性足場の行列です。これは移植後、それは骨の内部成長のための部屋を提供する融合ベッドに再吸収されます。ポリ-L-リジン(PLL)またはプロタミン(この場合は、アルギン酸マイクロビーズキャリアコア)足場マトリックスと負に帯電したヘパリンの両方とインタレースするカチオン性層として使用されます。アニオン性ヘパリン層の機能は、ロードされた成長因子を安定化し、局在化しています。三層PECは、ブタモデル9における成長因子負荷容量を増加させることが示されています。近年、PECキャリアは正常ラット10と脊椎8のブタモデルにおいて少なくとも20倍のBMP-2の有効量を減少させることが示されています。
ntent ">ここでは、我々はモデル骨形成増殖因子としてBMP-2を使用して、脊椎固定術で強化された成長因子の配信および他の再建骨手術のためのPECを製造する方法を報告しています。このプロトコルは、レイヤーバイレイヤー自己組織化を通じたPECの調製のための方法を提示しています。層ごとの構造は、プロタミン、ヘパリン、BMP-2およびNELL-1および共焦点顕微鏡の蛍光類似体を用いて可視化されます。取り込みおよび放出試験は、PECのヘパリンは骨形成成長因子の取り込み及び放出を媒介することを示します。 PEC法の取り込み効率は次のとおりです。NELL-1:86.7±2.7%、B…
The authors have nothing to disclose.
These studies were funded by National Medical Research Council Clinician Scientist – Individual Research Grant (CS-IRG) NMRC/CIRG/1372/2013 and NMRC EDG/0022/2008.
Life Science Acrodisc 25mm Syring Filter w/0.2 µm Supor Membrane | PALL | PN4612 | Sterile protamine, heparin solution by ultrafiltration |
24 well plate | Cell Star | 662160 | |
96 well plate Nuclon Delta Surface | Thermo Fisher Scientific | 167008 | |
(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide), MTT | Sigma Aldrich | M5655 | Measure cytotoxicity of PEC-NELL-1 |
Acetone | Fisher Scientific | A/0600/17 | Precipitate CF-405 Labelled protamine |
Alamar Blue | Invitrogen, Life Technologies | DAL 1025 | Measure cytotoxicity of PEC-BMP-2 |
Alkaline Phosphatase Assay (ALP) assay kit | Anaspec | AS-72146 | |
Ammonium Chloride | Merck | Art 1145 | Stop reagent in FITC labelling |
Anhydrous Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Invitrogen, Life Technologies | D12345 | Solvent for fluorescent isothiocyanate I |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | Dissolve formazan | |
Autoclave | Hirayama | HU-110 | Sterilize alginate beads by steam |
Beta-glycerophosphate | Sigma Aldrich | G9422 | |
BMP-2 (Infuse Bone Graft Large II Kit) | Medtronic Sofarmor Danek, Memphis TN, USA | 7510800 | Osteogenic Growth Factor, dialysis is needed to remove stabilizer component that interferes with FITC coupling |
Carboxybenzoyl quinoline-2-Carboxaldehyde (CBQCA) | Thermo Fisher Scientific | A-6222 | To quantify NELL-1 protein |
Cell Strainer (100µm) | BD Science | 352360 | Hold PEC for ALP assay |
Cell Scraper 290mm Bladewide 20mm | SPL Life Science | 90030 | Detach the cell from 24 well plate |
CF 405S, Succinimidyl Ester | Sigma Aldrich | SCJ4600013 | Blue fluorescent dye for protamine labelling |
CF 594, Hydrazide | Sigma Aldrich | SCJ4600031 | Deep red fluorescent dye for heparin labelling |
Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | |
Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | Component of osteogenic growth medium |
Dextran Desalting Columns | Pierce (Thermo Scientific) | 43230 | |
DMEM | Gibco | 12320 | |
BMP-2 Quantikine ELISA Kit | R&D System | DBP200 | Determine BMP-2 release |
Fetal Bovine Serum FBS | Hyclone | SV30160.03 | |
Fluoescein Isothiocyananate, Isomer I | Sigma Aldrich | F7250 | Green fluorescent dye for NELL-1 and BMP-2 labelling |
ThinCert Cell Culture Inserts, For 24 Well plates, Sterile |
Greiner | 662630 | Prevents PEC wash out when changing osteogenic medium |
Havard Appartus Syringe Pump (11 plus) | Havard Apparatus | 70-2208 | |
n-Hexane (>99%) | Sigma Aldrich | 139386 | |
Heparin | Sigma Aldrich | H3149 | Binds with osteogenic growth factor with heparin binding domain |
Hydrochloric acid (37%) | Merck | 100317 | Highly Corrosive |
Incubator | Binder | C8150 | |
MicroBCA Protein Assay kit | Thermoscientific | 23235 | |
Microplate Reader | Tecan | Infinite M200 | For ALP and microBCA assays |
NELL-1 | Aragen Bioscience Morgan Hill, CA, USA | N/A | Osteogenic growth factor, keep at -80˚C |
Nisco cell encapsulator | Nisco Engineering Inc | Encapsulation unit VAR V1 | |
Fluorescent Microscope | Olympus | IX71 | |
mPCL-TCP Scaffold (Pore size is 1.3mm) | Osteopore | PCL-TCP 0/90 | Hold PEC for in vivo study |
Penicillin-Streptomycin 10,000 unit/ml, 100ml | Hyclone Cell Culture | SV30010 | Antibiotic |
10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | Vivantis | PB0344-1L | 10x Solution, Ultra Pure Grade |
Poly-L-Lysine MW 15,000-30,000 | Sigma Aldrich | P2568 | Polycation |
Protamine Sulfate salt, from Salmon | Sigma Aldrich | P4020 | Polycation |
Shaker | Labnet | S2025 | |
Snakeskin Dialysis Tubing 3,500 MWCO 22mm x 35 feet | Thermo Fisher Scientific | 68035 | Remove unreacted FITC by dialysis |
Sodium Chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
Sodium Hydroxide | Qrec | S5158 | |
Sodium Bicarbonate | US Biological | S4000 | Buffer |
Sodium carbonate | Sigma Aldrich | S7795-500G | Buffer |
Strontium Chloride Hexahydrate | Sigma Aldrich | 255521 | Crosslinker for alginate |
Spatula | 3dia | ||
5ml syringe | Terumo | 140425R | Diameter of syringe affects the flow rate |
75cm2 Cell Culture Flask Canted Neck | Corning | 730720 | |
Toluidine Blue | Sigma Aldrich | 52040 | Heparin assay |
Trypsin 1X | Hyclone Cell Culture | SH30042.01 | |
Sodium alginate | Novamatrix (FMC Biopolymer, Princeton, NJ) | Pronova UPMVG | Core material of microbeads |