Complexo polielectrólito de ligação à heparina de entrega osteogénica Factor de Crescimento Domínio
Summary
Self-assembled polyelectrolyte complexes (PEC) fabricated from heparin and protamine were deposited on alginate beads to entrap and regulate the release of osteogenic growth factors. This delivery strategy enables a 20-fold reduction of BMP-2 dose in spinal fusion applications. This article illustrates the benefits and fabrication of PECs.
Abstract
Durante cirurgias ósseas reconstrutivas, quantidades suprafisiológicas de fatores de crescimento são empiricamente carregado em andaimes para promover a fusão óssea bem sucedido. Grandes doses de agentes biológicos muito potentes são necessários devido ao factor de instabilidade do crescimento, como resultado da degradação enzimática rápida, bem como as ineficiências transportadora na localização de uma quantidade suficiente de factor de crescimento em locais de implante. Assim, estratégias que prolongam a estabilidade de factores de crescimento, tais como BMP-2 / NELL-1, e controlar a sua libertação pode realmente diminuir a dose eficaz e, assim, reduzir a necessidade de doses mais elevadas durante as futuras cirurgias de regeneração óssea. Isto por sua vez irá reduzir os efeitos secundários e os custos de factores de crescimento. PEC auto-montadas têm sido fabricados para proporcionar um melhor controlo de PMO-2 / NELL-1 entrega através de ligação à heparina e outro factor de crescimento bioactividade potenciam reforço, em estabilidade in vivo. Aqui, ilustramos a simplicidade de fabricação PEC que auxilia na DELIVERY de uma variedade de factores de crescimento durante cirurgias reconstrutivas ósseas.
Introduction
A incidência de pseudoartrose tem sido relatada como sendo tão elevado como 10 a 45% em fusão espinal degenerativa e revisão cirurgias espinhais 1. Para reduzir a taxa de pseudoartrose durante a fusão da coluna e outras cirurgias reconstrutivas ósseas, factores de crescimento osteogénico, tais como BMP-2, Nell-1 e um factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) foram introduzidos para promover a osteogénese de novo. Entre estes, BMP-2 é uma escolha popular para a fusão espinhal 2. Embora a potência de BMP-2 na indução e facilitando a formação de osso novo foi bem estabelecido 3; complicações clinicamente significativos, tais como a formação heterotópica de osso, seroma e formação de hematoma, resposta inflamatória, radiculite, osteólise corpo vertebral, e ejaculação retrógrada continuam a ser questões de preocupação devido às quantidades suprafisiológicas utilizados 4,5.
Por isso, diminuindo a dose de PMO-2 continua a ser uma estratégia relevante em pelotenta a minimizar os efeitos colaterais. Além disso, sistemas de veículo eficazes são necessários para suprimir a libertação brusca inicial de BMP-2 observado em sistemas veiculares de esponja de colagénio contemporânea e aumentar ainda mais a entrega prolongada e localizada desta citoquina potente. A auto-montagem da camada-por-camada da alternância polielectrólitos catiónicos e aniónicos podem ser utilizados como um método sintonizável para construir-se complexos de polielectrólitos na superfície de matrizes de andaime ou materiais implantáveis 6. A este respeito, a heparina (conhecida por ter a maior densidade de carga negativa de todos os agentes biológicos) tem sido reconhecido que se ligam avidamente com uma variedade de factores de crescimento através de domínios de ligação a heparina e electrostáticas. Com efeito, a heparina tem sido mostrada a prolongar a meia-vida e assim potenciar a bioactividade de vários factores de crescimento.
Com base nisso, o nosso grupo de um protocolo adaptado de auto-montagem da camada-por-camada para o fabrico de um complexo à base de polielectrólito heparina (PEC) que cargas e preserva as bioatividades de fatores de crescimento osteogénico durante a imobilização 7,8. O núcleo microesferas de alginato foi fabricado por reticulação de resíduos de alginato com catiões divalentes de cálcio ou estrôncio α-L-guluronato (L). O núcleo é uma matriz de alginato biodegradável andaime; que depois da implantação, é reabsorvido no leito de fusão proporcionando espaço para crescimento ósseo. A poli-L-lisina (PLL) ou protamina é utilizada como a camada de catiónico para entrelaçar com tanto a matriz de andaime (neste caso, o núcleo de alginato transportador micropérola) e a heparina carregada negativamente; enquanto que as funções da camada de heparina aniónico para estabilizar e localizar factores de crescimento carregados. A camada tripla PEC foi mostrada para aumentar a capacidade de carga do factor de crescimento num modelo suíno 9. Recentemente, os transportadores de PEC tenham sido demonstrado com sucesso para reduzir a dose eficaz de BMP-2 em pelo menos 20 vezes em ratos 10 e modelos de suíno de fusão vertebral 8.
ntent "> Aqui, nós relatamos os métodos de PECs de fabricação para a entrega do fator de crescimento reforçada em fusão espinhal e as outras cirurgias ósseas de reconstrução utilizando BMP-2 como um factor de crescimento osteogénico modelo.Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo apresenta um método para a preparação de CPE através de camada-por-camada de auto-montagem. A estrutura de camada-por-camada é visualizada utilizando análogos fluorescentes de protamina, heparina, BMP-2 e NELL-1 e microscopia confocal. Captação e testes de libertação mostram que heparinas de PEC medeia a captação fator de crescimento osteogénico e solte. A eficiência de absorção do método de PEC é: NELL-1: 86,7 ± 2,7%, BMP-2: 70,5 ± 3,1%. O transportador PEC tem uma melhor modulação …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
These studies were funded by National Medical Research Council Clinician Scientist – Individual Research Grant (CS-IRG) NMRC/CIRG/1372/2013 and NMRC EDG/0022/2008.
Materials
| Life Science Acrodisc 25mm Syring Filter w/0.2 µm Supor Membrane | PALL | PN4612 | Sterile protamine, heparin solution by ultrafiltration |
| 24 well plate | Cell Star | 662160 | |
| 96 well plate Nuclon Delta Surface | Thermo Fisher Scientific | 167008 | |
| (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide), MTT | Sigma Aldrich | M5655 | Measure cytotoxicity of PEC-NELL-1 |
| Acetone | Fisher Scientific | A/0600/17 | Precipitate CF-405 Labelled protamine |
| Alamar Blue | Invitrogen, Life Technologies | DAL 1025 | Measure cytotoxicity of PEC-BMP-2 |
| Alkaline Phosphatase Assay (ALP) assay kit | Anaspec | AS-72146 | |
| Ammonium Chloride | Merck | Art 1145 | Stop reagent in FITC labelling |
| Anhydrous Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Invitrogen, Life Technologies | D12345 | Solvent for fluorescent isothiocyanate I |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | Dissolve formazan | |
| Autoclave | Hirayama | HU-110 | Sterilize alginate beads by steam |
| Beta-glycerophosphate | Sigma Aldrich | G9422 | |
| BMP-2 (Infuse Bone Graft Large II Kit) | Medtronic Sofarmor Danek, Memphis TN, USA | 7510800 | Osteogenic Growth Factor, dialysis is needed to remove stabilizer component that interferes with FITC coupling |
| Carboxybenzoyl quinoline-2-Carboxaldehyde (CBQCA) | Thermo Fisher Scientific | A-6222 | To quantify NELL-1 protein |
| Cell Strainer (100µm) | BD Science | 352360 | Hold PEC for ALP assay |
| Cell Scraper 290mm Bladewide 20mm | SPL Life Science | 90030 | Detach the cell from 24 well plate |
| CF 405S, Succinimidyl Ester | Sigma Aldrich | SCJ4600013 | Blue fluorescent dye for protamine labelling |
| CF 594, Hydrazide | Sigma Aldrich | SCJ4600031 | Deep red fluorescent dye for heparin labelling |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | Component of osteogenic growth medium |
| Dextran Desalting Columns | Pierce (Thermo Scientific) | 43230 | |
| DMEM | Gibco | 12320 | |
| BMP-2 Quantikine ELISA Kit | R&D System | DBP200 | Determine BMP-2 release |
| Fetal Bovine Serum FBS | Hyclone | SV30160.03 | |
| Fluoescein Isothiocyananate, Isomer I | Sigma Aldrich | F7250 | Green fluorescent dye for NELL-1 and BMP-2 labelling |
| ThinCert Cell Culture Inserts, For 24 Well plates, Sterile |
Greiner | 662630 | Prevents PEC wash out when changing osteogenic medium |
| Havard Appartus Syringe Pump (11 plus) | Havard Apparatus | 70-2208 | |
| n-Hexane (>99%) | Sigma Aldrich | 139386 | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149 | Binds with osteogenic growth factor with heparin binding domain |
| Hydrochloric acid (37%) | Merck | 100317 | Highly Corrosive |
| Incubator | Binder | C8150 | |
| MicroBCA Protein Assay kit | Thermoscientific | 23235 | |
| Microplate Reader | Tecan | Infinite M200 | For ALP and microBCA assays |
| NELL-1 | Aragen Bioscience Morgan Hill, CA, USA | N/A | Osteogenic growth factor, keep at -80˚C |
| Nisco cell encapsulator | Nisco Engineering Inc | Encapsulation unit VAR V1 | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | IX71 | |
| mPCL-TCP Scaffold (Pore size is 1.3mm) | Osteopore | PCL-TCP 0/90 | Hold PEC for in vivo study |
| Penicillin-Streptomycin 10,000 unit/ml, 100ml | Hyclone Cell Culture | SV30010 | Antibiotic |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | Vivantis | PB0344-1L | 10x Solution, Ultra Pure Grade |
| Poly-L-Lysine MW 15,000-30,000 | Sigma Aldrich | P2568 | Polycation |
| Protamine Sulfate salt, from Salmon | Sigma Aldrich | P4020 | Polycation |
| Shaker | Labnet | S2025 | |
| Snakeskin Dialysis Tubing 3,500 MWCO 22mm x 35 feet | Thermo Fisher Scientific | 68035 | Remove unreacted FITC by dialysis |
| Sodium Chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
| Sodium Hydroxide | Qrec | S5158 | |
| Sodium Bicarbonate | US Biological | S4000 | Buffer |
| Sodium carbonate | Sigma Aldrich | S7795-500G | Buffer |
| Strontium Chloride Hexahydrate | Sigma Aldrich | 255521 | Crosslinker for alginate |
| Spatula | 3dia | ||
| 5ml syringe | Terumo | 140425R | Diameter of syringe affects the flow rate |
| 75cm2 Cell Culture Flask Canted Neck | Corning | 730720 | |
| Toluidine Blue | Sigma Aldrich | 52040 | Heparin assay |
| Trypsin 1X | Hyclone Cell Culture | SH30042.01 | |
| Sodium alginate | Novamatrix (FMC Biopolymer, Princeton, NJ) | Pronova UPMVG | Core material of microbeads |
Riferimenti
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