Полиэлектролита Комплекс для гепаринсвязывающий домена Остеогенная фактор роста Доставка
Summary
Self-assembled polyelectrolyte complexes (PEC) fabricated from heparin and protamine were deposited on alginate beads to entrap and regulate the release of osteogenic growth factors. This delivery strategy enables a 20-fold reduction of BMP-2 dose in spinal fusion applications. This article illustrates the benefits and fabrication of PECs.
Abstract
Во время реконструктивных операций костей, супрафизиологические количество факторов роста эмпирически загружены на строительные леса, чтобы способствовать успешному слиянию кости. Большие дозы сильнодействующих биологических агентов необходимы из-за нестабильности фактора роста в результате быстрого ферментативного разложения, а также носителей неэффективностью локализацией достаточное количество фактора роста на участки имплантации. Следовательно, стратегии, которые продлевают стабильность факторов роста, таких как BMP-2 / НЕЛЛ-1, а также контролировать их высвобождение может реально снизить эффективную дозу и, таким образом, уменьшить потребность в больших дозах во время будущих операций регенерации костной ткани. Это, в свою очередь, приведет к снижению побочных эффектов и затрат на фактор роста. Самоассоциированные УИКи были изготовлены для обеспечения лучшего контроля БМП-2 / НЕЛЛ-1 доставку через гепаринсвязывающий и еще один фактор роста биоактивности потенцировать за счет повышения естественных условиях стабильности. Здесь мы проиллюстрируем простоту изготовления ФЭП, который помогает в deliveRy из множества факторов роста во время реконструктивных операций костей.
Introduction
Частота ложных суставов , как сообщается, может достигать от 10 до 45% при дегенеративных спондилодез и пересмотров операции на позвоночнике 1. Для снижения скорости псевдоартрозов во время спондилодеза и других реконструктивных операциях костей, остеогенных факторы роста , такие как BMP-2, Нелл-1 1 и тромбоцитарный фактор роста (PDGF) были введены в целях содействия De Novo остеогенез. Среди них, БМП-2 является популярным выбором для спондилодеза 2. Хотя эффективность БМП-2 в стимулировании и облегчении образования новой кости хорошо установлено 3; клинически значимые осложнения , такие как гетеротопной формирования костной ткани, серома и образования гематомы, воспалительной реакции, радикулите, позвоночной остеолиза тела, и ретроградной эякуляции продолжают оставаться вопросы, вызывающие озабоченность в связи с супрафизиологического суммами , используемыми 4,5.
Таким образом, снижая дозу BMP-2 остается соответствующую стратегию наманит, чтобы минимизировать побочные эффекты. Кроме того, эффективные системы носителей необходимы для подавления первоначального выпуска разрыва БМП-2 наблюдается в современной коллагеновые губки систем-носителей и дальнейшего повышения длительной и локализованной доставки этого мощного цитокина. Слой за слоем , самосборка чередующихся катионного и анионного полиэлектролитов могут быть использованы в качестве перестраиваемого метода для формирования до полиэлектролитных комплексов на поверхности матриц строительных лесах или имплантируемых материалов 6. В этом отношении, гепарин (известный, имеющие самую высокую отрицательную плотность заряда всех биологических агентов) был признан запоем связываться с различными факторами роста за счет электростатических и гепарин связывающих доменов. Действительно, гепарин, как было показано, чтобы продлить период полураспада и, таким образом, потенцируют биоактивности нескольких факторов роста.
Исходя из этого, наша группа адаптировали слой за слоем протокола самосборки для изготовления гепарином на основе полиэлектролита комплекс (PEC), что грузы и сохраняет биоактивности остеогенных факторов роста во время иммобилизации 7,8. Ядро альгинат Microbead был изготовлен сшивающий -L-guluronate (G) остатки альгината с ионами двухвалентных катионов кальция или стронций. Ядро альгинат представляет собой биоразлагаемый матрица строительных лесов; который после имплантации, она рассасывается в гибридном кровати, обеспечивая пространство для костистых врастания. Поли-L-лизин (ФАПЧ) или протамин используется в качестве катионного слоя переплетаются с обеих матрицы подмостей (в данном случае, ядро альгинат Microbead носитель) и отрицательно заряженного гепарина; в то время как функции анионные гепарин слой, чтобы стабилизировать и локализовать нагруженных факторы роста. Тройной слой PEC было показано увеличение мощности нагрузки фактора роста в модели свиньи 9. В последнее время , носители PEC было показано , что успешно уменьшить эффективную дозу BMP-2 , по крайней мере , в 20 раз в 10 крыс и свиней моделей спондилодез 8.
ntent "> Здесь мы сообщаем методы изготовления УИКов для расширенной доставки фактора роста в спондилодез и других реконструктивных операций с использованием костей БМП-2 в качестве фактора роста остеогенной модели.Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол представляет собой способ получения избирательных участков через слой за слоем самосборки. Структура послойный визуализируется с использованием флуоресцентных аналогов протамин, гепарин, BMP-2 и НЕЛЛ-1 и конфокальной микроскопии. Усвоение и высвобождают тесты показывают…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
These studies were funded by National Medical Research Council Clinician Scientist – Individual Research Grant (CS-IRG) NMRC/CIRG/1372/2013 and NMRC EDG/0022/2008.
Materials
| Life Science Acrodisc 25mm Syring Filter w/0.2 µm Supor Membrane | PALL | PN4612 | Sterile protamine, heparin solution by ultrafiltration |
| 24 well plate | Cell Star | 662160 | |
| 96 well plate Nuclon Delta Surface | Thermo Fisher Scientific | 167008 | |
| (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide), MTT | Sigma Aldrich | M5655 | Measure cytotoxicity of PEC-NELL-1 |
| Acetone | Fisher Scientific | A/0600/17 | Precipitate CF-405 Labelled protamine |
| Alamar Blue | Invitrogen, Life Technologies | DAL 1025 | Measure cytotoxicity of PEC-BMP-2 |
| Alkaline Phosphatase Assay (ALP) assay kit | Anaspec | AS-72146 | |
| Ammonium Chloride | Merck | Art 1145 | Stop reagent in FITC labelling |
| Anhydrous Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Invitrogen, Life Technologies | D12345 | Solvent for fluorescent isothiocyanate I |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | Dissolve formazan | |
| Autoclave | Hirayama | HU-110 | Sterilize alginate beads by steam |
| Beta-glycerophosphate | Sigma Aldrich | G9422 | |
| BMP-2 (Infuse Bone Graft Large II Kit) | Medtronic Sofarmor Danek, Memphis TN, USA | 7510800 | Osteogenic Growth Factor, dialysis is needed to remove stabilizer component that interferes with FITC coupling |
| Carboxybenzoyl quinoline-2-Carboxaldehyde (CBQCA) | Thermo Fisher Scientific | A-6222 | To quantify NELL-1 protein |
| Cell Strainer (100µm) | BD Science | 352360 | Hold PEC for ALP assay |
| Cell Scraper 290mm Bladewide 20mm | SPL Life Science | 90030 | Detach the cell from 24 well plate |
| CF 405S, Succinimidyl Ester | Sigma Aldrich | SCJ4600013 | Blue fluorescent dye for protamine labelling |
| CF 594, Hydrazide | Sigma Aldrich | SCJ4600031 | Deep red fluorescent dye for heparin labelling |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | Component of osteogenic growth medium |
| Dextran Desalting Columns | Pierce (Thermo Scientific) | 43230 | |
| DMEM | Gibco | 12320 | |
| BMP-2 Quantikine ELISA Kit | R&D System | DBP200 | Determine BMP-2 release |
| Fetal Bovine Serum FBS | Hyclone | SV30160.03 | |
| Fluoescein Isothiocyananate, Isomer I | Sigma Aldrich | F7250 | Green fluorescent dye for NELL-1 and BMP-2 labelling |
| ThinCert Cell Culture Inserts, For 24 Well plates, Sterile |
Greiner | 662630 | Prevents PEC wash out when changing osteogenic medium |
| Havard Appartus Syringe Pump (11 plus) | Havard Apparatus | 70-2208 | |
| n-Hexane (>99%) | Sigma Aldrich | 139386 | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149 | Binds with osteogenic growth factor with heparin binding domain |
| Hydrochloric acid (37%) | Merck | 100317 | Highly Corrosive |
| Incubator | Binder | C8150 | |
| MicroBCA Protein Assay kit | Thermoscientific | 23235 | |
| Microplate Reader | Tecan | Infinite M200 | For ALP and microBCA assays |
| NELL-1 | Aragen Bioscience Morgan Hill, CA, USA | N/A | Osteogenic growth factor, keep at -80˚C |
| Nisco cell encapsulator | Nisco Engineering Inc | Encapsulation unit VAR V1 | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | IX71 | |
| mPCL-TCP Scaffold (Pore size is 1.3mm) | Osteopore | PCL-TCP 0/90 | Hold PEC for in vivo study |
| Penicillin-Streptomycin 10,000 unit/ml, 100ml | Hyclone Cell Culture | SV30010 | Antibiotic |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | Vivantis | PB0344-1L | 10x Solution, Ultra Pure Grade |
| Poly-L-Lysine MW 15,000-30,000 | Sigma Aldrich | P2568 | Polycation |
| Protamine Sulfate salt, from Salmon | Sigma Aldrich | P4020 | Polycation |
| Shaker | Labnet | S2025 | |
| Snakeskin Dialysis Tubing 3,500 MWCO 22mm x 35 feet | Thermo Fisher Scientific | 68035 | Remove unreacted FITC by dialysis |
| Sodium Chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
| Sodium Hydroxide | Qrec | S5158 | |
| Sodium Bicarbonate | US Biological | S4000 | Buffer |
| Sodium carbonate | Sigma Aldrich | S7795-500G | Buffer |
| Strontium Chloride Hexahydrate | Sigma Aldrich | 255521 | Crosslinker for alginate |
| Spatula | 3dia | ||
| 5ml syringe | Terumo | 140425R | Diameter of syringe affects the flow rate |
| 75cm2 Cell Culture Flask Canted Neck | Corning | 730720 | |
| Toluidine Blue | Sigma Aldrich | 52040 | Heparin assay |
| Trypsin 1X | Hyclone Cell Culture | SH30042.01 | |
| Sodium alginate | Novamatrix (FMC Biopolymer, Princeton, NJ) | Pronova UPMVG | Core material of microbeads |
Riferimenti
- Yuan, W., et al. NELL-1 based demineralized bone graft promotes rat spine fusion as compared to commercially available BMP-2 product. Orthop Sci. 18, 646-657 (2013).
- Anderson, C. L., Whitaker, M. C. Heterotopic ossification associated with recombinant human bone morphogenetic protein-2 (infuse) in posterolateral lumbar spine fusion: a case report. Spine. 37, 502-506 (2012).
- Glassman, S. D., et al. RhBMP-2 versus iliac crest bone graft for lumbar spine fusion: a randomized, controlled trial in patients over sixty years of age. Spine. 33, 2843-2849 (2008).
- Tannoury, C. A., An, H. S. Complications with the use of bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) in spine surgery. Spine J. 14, 552-559 (2014).
- Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned. Spine J. 11, 471-491 (2011).
- Abbah, S. A., Lam, C. X., Hutmacher, D. W., Goh, J. C., Wong, H. K. Biological performance of a polycaprolactone-based scaffold used as fusion cage device in a large animal model of spinal reconstructive surgery. Biomaterials. 30, 5086-5093 (2009).
- Abbah, S. A., Liu, J., Lam, R. W., Goh, J. C., Wong, H. K. In vivo bioactivity of rhBMP-2 delivered with novel polyelectrolyte complexation shells assembled on an alginate microbead core template. J. Control. Release. 162, 364-372 (2012).
- Wang, M., et al. Polyelectrolyte Complex Carrier Enhances Therapeutic Efficiency and Safety Profile of Bone Morphogenetic Protein-2 in Porcine Lumbar Interbody Fusion Model. Spine. 40, 964-973 (2015).
- Abbah, S. A., Lam, W. M., Hu, T., Goh, J., Wong, H. K. Sequestration of rhBMP-2 into self-assembled polyelectrolyte complexes promotes anatomic localization of new bone in a porcine model of spinal reconstructive surgery. Tissue Eng. Part A. 20, 1679-1688 (2014).
- Hu, T., et al. Novel Protamine-Based Polyelectrolyte Carrier Enhances Low-Dose rhBMP-2 in Posterolateral Spinal Fusion. Spine. 40, 613-621 (2015).
- Hu, J., Hou, Y., Park, H., Lee, M. Beta-tricalcium phosphate particles as a controlled release carrier of osteogenic proteins for bone tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 100, 1680-1686 (2012).
- Darrabie, M. D., Kendall, W. F., Opara, E. C. Characteristics of Poly-L-Ornithine-coated alginate microcapsules. Biomaterials. 26, 6846-6852 (2005).
- Li, X., Min, S., Zhao, X., Lu, Z., Jin, A. Optimization of entrapping conditions to improve the release of BMP-2 from PELA carriers by response surface methodology. Biomed Mater. 10, 015002 (2015).
