Complejo de polielectrolito para la unión a heparina de entrega osteogénico Factor de Crecimiento de dominio
Summary
Self-assembled polyelectrolyte complexes (PEC) fabricated from heparin and protamine were deposited on alginate beads to entrap and regulate the release of osteogenic growth factors. This delivery strategy enables a 20-fold reduction of BMP-2 dose in spinal fusion applications. This article illustrates the benefits and fabrication of PECs.
Abstract
Durante cirugías reconstructivas óseas, cantidades suprafisiológicas de factores de crecimiento se cargan empíricamente en los andamios para promover la fusión ósea exitosa. Se requieren grandes dosis de agentes biológicos altamente potentes debido a la inestabilidad del factor de crecimiento como resultado de la rápida degradación enzimática, así como las ineficiencias de soporte en la localización de cantidades suficientes de factor de crecimiento en los sitios de implante. Por lo tanto, las estrategias que prolonguen la estabilidad de los factores de crecimiento, tales como BMP-2 / NELL-1, y controlan su liberación en realidad podría disminuir su dosis eficaz y, por tanto, reducir la necesidad de dosis mayores durante las futuras cirugías de regeneración ósea. Esto a su vez reducirá los efectos secundarios y costos de los factores de crecimiento. Los PEC autoensambladas se han fabricado para proporcionar un mejor control de la BMP-2 / NELL-1 a través de la entrega de unión a la heparina y el factor de mayor bioactividad crecimiento potencian mediante la mejora de la estabilidad in vivo. Aquí se ilustra la simplicidad de fabricación PEC que ayuda en la delivery de una variedad de factores de crecimiento durante las cirugías óseas reconstructivos.
Introduction
La incidencia de pseudoartrosis se ha reportado que ser tan alta como 10 a 45% en la fusión espinal degenerativa y revisión cirugías de columna 1. Para reducir la tasa de pseudoartrosis durante la fusión columna vertebral y otras cirugías reconstructivas óseas, se han introducido factores de crecimiento osteogénicos tales como BMP-2, Nell-1 1 y factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) para promover la osteogénesis de novo. Entre estos, BMP-2 es una opción popular para la fusión espinal 2. Aunque la potencia de la BMP-2 en la inducción y facilitación de la formación de hueso nuevo ha sido bien establecida 3; complicaciones clínicamente importantes, tales como la formación de hueso heterotópico, seroma y la formación de hematomas, respuesta inflamatoria, radiculitis, osteolisis cuerpo vertebral, y la eyaculación retrógrada siguen siendo temas de preocupación debido a las cantidades utilizadas supraphysiological 4,5.
Por lo tanto, la reducción de la dosis de BMP-2 sigue siendo una estrategia relevante en altienta para minimizar los efectos secundarios. Además, se requieren sistemas de portadores eficaces para suprimir la liberación de ráfaga inicial de BMP-2 observada en los sistemas de portadora de esponja de colágeno contemporáneo y mejorar aún más la administración prolongada y localizada de esta potente citoquina. La auto-ensamblaje capa por capa de polielectrolitos catiónicos alterna y aniónicos puede ser empleado como un método sintonizable para construir complejos de polielectrolito en la superficie de matrices de andamio o materiales implantables 6. A este respecto, la heparina (conocido por tener la densidad de carga negativa más alta de todos los agentes biológicos) ha sido reconocido para unir ávidamente con una variedad de factores de crecimiento a través de los dominios de unión electrostáticas y heparina. De hecho, la heparina se ha demostrado prolongar la vida media y por lo tanto potenciar la bioactividad de varios factores de crecimiento.
Basado en esto, nuestro grupo adaptado un protocolo de auto-ensamblaje capa por capa para fabricar un complejo de polielectrolito a base de heparina (PEC) que cargas y preserva las bioactividades de los factores de crecimiento osteogénicos durante la inmovilización 7,8. El núcleo de microperlas de alginato se fabricó por entrecruzamiento de residuos de alginato con iones de calcio de cationes divalentes o estroncio α-L-guluronato (G). El núcleo de alginato es una matriz andamio biodegradable; el cual después de la implantación, se reabsorbe en el lecho de fusión que proporciona espacio para el crecimiento óseo. Poli-L-lisina (PLL) o protamina se utiliza como la capa catiónica para entrelazar tanto con la matriz de andamio (en este caso, el núcleo de la portadora de microperlas de alginato) y la heparina cargada negativamente; mientras que las funciones de la capa de heparina aniónicos para estabilizar y localizar los factores de crecimiento cargados. El triple capa PEC se ha demostrado que aumenta la capacidad de carga del factor de crecimiento en un modelo porcino 9. Recientemente, portadores PEC han demostrado reducir con éxito la dosis efectiva de BMP-2 en al menos 20 veces en la rata 10 y modelos porcinos de fusión espinal 8.
ntent "> Aquí, se presenta los métodos de fabricación de los PEC para la entrega mejorada del factor de crecimiento en la fusión espinal y las otras cirugías reconstructivas óseas utilizando BMP-2 como un factor de crecimiento osteogénico modelo.Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo presenta un método para la preparación de los PEC través de la capa por capa de autoensamblaje. La estructura de capa por capa se visualizó usando análogos fluorescentes de protamina, heparina, BMP-2 y Nell-1 y microscopía confocal. La captación y análisis de liberación muestran que la heparina sobre los PEC media la captación del factor de crecimiento osteogénico y liberación. La eficiencia de absorción del método PEC es: NELL-1: 86,7 ± 2,7%, BMP-2: 70,5 ± 3,1%. El portador PEC tiene una …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
These studies were funded by National Medical Research Council Clinician Scientist – Individual Research Grant (CS-IRG) NMRC/CIRG/1372/2013 and NMRC EDG/0022/2008.
Materials
| Life Science Acrodisc 25mm Syring Filter w/0.2 µm Supor Membrane | PALL | PN4612 | Sterile protamine, heparin solution by ultrafiltration |
| 24 well plate | Cell Star | 662160 | |
| 96 well plate Nuclon Delta Surface | Thermo Fisher Scientific | 167008 | |
| (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide), MTT | Sigma Aldrich | M5655 | Measure cytotoxicity of PEC-NELL-1 |
| Acetone | Fisher Scientific | A/0600/17 | Precipitate CF-405 Labelled protamine |
| Alamar Blue | Invitrogen, Life Technologies | DAL 1025 | Measure cytotoxicity of PEC-BMP-2 |
| Alkaline Phosphatase Assay (ALP) assay kit | Anaspec | AS-72146 | |
| Ammonium Chloride | Merck | Art 1145 | Stop reagent in FITC labelling |
| Anhydrous Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Invitrogen, Life Technologies | D12345 | Solvent for fluorescent isothiocyanate I |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | Dissolve formazan | |
| Autoclave | Hirayama | HU-110 | Sterilize alginate beads by steam |
| Beta-glycerophosphate | Sigma Aldrich | G9422 | |
| BMP-2 (Infuse Bone Graft Large II Kit) | Medtronic Sofarmor Danek, Memphis TN, USA | 7510800 | Osteogenic Growth Factor, dialysis is needed to remove stabilizer component that interferes with FITC coupling |
| Carboxybenzoyl quinoline-2-Carboxaldehyde (CBQCA) | Thermo Fisher Scientific | A-6222 | To quantify NELL-1 protein |
| Cell Strainer (100µm) | BD Science | 352360 | Hold PEC for ALP assay |
| Cell Scraper 290mm Bladewide 20mm | SPL Life Science | 90030 | Detach the cell from 24 well plate |
| CF 405S, Succinimidyl Ester | Sigma Aldrich | SCJ4600013 | Blue fluorescent dye for protamine labelling |
| CF 594, Hydrazide | Sigma Aldrich | SCJ4600031 | Deep red fluorescent dye for heparin labelling |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | Component of osteogenic growth medium |
| Dextran Desalting Columns | Pierce (Thermo Scientific) | 43230 | |
| DMEM | Gibco | 12320 | |
| BMP-2 Quantikine ELISA Kit | R&D System | DBP200 | Determine BMP-2 release |
| Fetal Bovine Serum FBS | Hyclone | SV30160.03 | |
| Fluoescein Isothiocyananate, Isomer I | Sigma Aldrich | F7250 | Green fluorescent dye for NELL-1 and BMP-2 labelling |
| ThinCert Cell Culture Inserts, For 24 Well plates, Sterile |
Greiner | 662630 | Prevents PEC wash out when changing osteogenic medium |
| Havard Appartus Syringe Pump (11 plus) | Havard Apparatus | 70-2208 | |
| n-Hexane (>99%) | Sigma Aldrich | 139386 | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149 | Binds with osteogenic growth factor with heparin binding domain |
| Hydrochloric acid (37%) | Merck | 100317 | Highly Corrosive |
| Incubator | Binder | C8150 | |
| MicroBCA Protein Assay kit | Thermoscientific | 23235 | |
| Microplate Reader | Tecan | Infinite M200 | For ALP and microBCA assays |
| NELL-1 | Aragen Bioscience Morgan Hill, CA, USA | N/A | Osteogenic growth factor, keep at -80˚C |
| Nisco cell encapsulator | Nisco Engineering Inc | Encapsulation unit VAR V1 | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | IX71 | |
| mPCL-TCP Scaffold (Pore size is 1.3mm) | Osteopore | PCL-TCP 0/90 | Hold PEC for in vivo study |
| Penicillin-Streptomycin 10,000 unit/ml, 100ml | Hyclone Cell Culture | SV30010 | Antibiotic |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | Vivantis | PB0344-1L | 10x Solution, Ultra Pure Grade |
| Poly-L-Lysine MW 15,000-30,000 | Sigma Aldrich | P2568 | Polycation |
| Protamine Sulfate salt, from Salmon | Sigma Aldrich | P4020 | Polycation |
| Shaker | Labnet | S2025 | |
| Snakeskin Dialysis Tubing 3,500 MWCO 22mm x 35 feet | Thermo Fisher Scientific | 68035 | Remove unreacted FITC by dialysis |
| Sodium Chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
| Sodium Hydroxide | Qrec | S5158 | |
| Sodium Bicarbonate | US Biological | S4000 | Buffer |
| Sodium carbonate | Sigma Aldrich | S7795-500G | Buffer |
| Strontium Chloride Hexahydrate | Sigma Aldrich | 255521 | Crosslinker for alginate |
| Spatula | 3dia | ||
| 5ml syringe | Terumo | 140425R | Diameter of syringe affects the flow rate |
| 75cm2 Cell Culture Flask Canted Neck | Corning | 730720 | |
| Toluidine Blue | Sigma Aldrich | 52040 | Heparin assay |
| Trypsin 1X | Hyclone Cell Culture | SH30042.01 | |
| Sodium alginate | Novamatrix (FMC Biopolymer, Princeton, NJ) | Pronova UPMVG | Core material of microbeads |
Riferimenti
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