Self-assembled polyelectrolyte complexes (PEC) fabricated from heparin and protamine were deposited on alginate beads to entrap and regulate the release of osteogenic growth factors. This delivery strategy enables a 20-fold reduction of BMP-2 dose in spinal fusion applications. This article illustrates the benefits and fabrication of PECs.
Under rekonstruktiv ben operationer, är suprafysiologiska mängder av tillväxtfaktorer empiriskt lastas på ställningar för att främja framgångsrika ben fusion. Stora doser av mycket potenta biologiska medel krävs på grund av tillväxtfaktor instabilitet till följd av snabb nedbrytning enzymatisk liksom bärare ineffektivitet i att lokalisera tillräckliga mängder av tillväxtfaktor på implantatställen. Därför strategier som förlänger stabiliteten av tillväxtfaktorer såsom BMP-2 / NELL-1, och kontrollera deras frigivning kan faktiskt sänka sina effektiva dos och därmed minska behovet av större doser under kommande benersättningsmaterial operationer. Detta i sin tur kommer att minska biverkningar och tillväxtfaktorkostnader. Själv monterade PEC har tillverkats för att ge bättre kontroll av BMP-2 / NELL-en leverans via heparinbindning och ytterligare GÖRA MÖJLIGT tillväxtfaktor bioaktivitet genom att öka in vivo-stabilitet. Här visar vi enkelheten PEC tillverkning som stöd i delivery av en mängd olika tillväxtfaktorer under rekonstruktiv ben operationer.
Förekomsten av pseudoartros har rapporterats vara så hög som 10 till 45% i degenerativ ryggradsfusions och revisions spinal operationer 1. För att minska graden av pseudartros under ryggraden fusion och andra rekonstruktiv ben operationer, osteogena tillväxtfaktorer såsom BMP-2, Nell-1 1 och blodplättshärledd tillväxtfaktor (PDGF) har införts för att främja de novo osteogenes. Bland dessa är BMP-2 ett populärt val för ryggradsfusion 2. Även om styrkan av BMP-2 i att inducera och underlätta ny benbildning har varit väl etablerat 3; kliniskt signifikanta komplikationer såsom heterotopisk benbildning, serom och hematom, inflammatoriskt svar, radikulit, kotkroppen osteolys, och retrograd ejakulation fortsätter att vara angelägna frågor på grund av de suprafysiologiska mängder som används 4,5.
Därför att sänka dosen av BMP-2 är fortfarande en relevant strategi i åtminfrestar att minimera biverkningar. Dessutom är effektiva bärarsystem som krävs för att undertrycka den initiala utbrottet frisättning av BMP-2 observerades i samtida kollagensvamp bärarsystem och ytterligare stärka förlängd och lokal administrering av denna potenta cytokin. Den lager-för-lager självsammansättning av alternerande katjoniska och anjoniska polyelektrolyter kan användas som en avstämbar metod för att bygga upp polyelektrolytkomplex på ytan av byggnadsställnings matriser eller implanterbara material 6. I detta avseende, har heparin (känd för att ha den högsta negativa laddningstätheten för alla biologiska medel) varit känt att avidly binda med en mängd olika tillväxtfaktorer via elektrostatiska och heparinbindande domäner. I själva verket har heparin visats förlänga halveringstiden och därmed potentiera bioaktiviteten av flera tillväxtfaktorer.
Baserat på detta, vår grupp anpassat ett skikt-vid-skikt självsammansättning protokoll för att tillverka en heparin-baserat polyelektrolytkomplex (PEC) som laster och bevarar bioaktiviteten av osteogena tillväxtfaktorer under immobilisering 7,8. Alginat mikrokorn kärna tillverkades genom tvärbindning av α-L-guluronat (G) rester av alginat med tvåvärd katjon kalcium- eller strontiumjoner. Alginat kärnan är en biologiskt nedbrytbar scaffold matris; som efter implantation, är det resorberas i fusions säng ger utrymme för benig inväxt. Poly-L-lysin (PLL) eller protamin användes som katjoniska skiktet till interlace med både byggnadsställningsmatrisen (i detta fall, alginat microbead bäraren kärna) och den negativt laddade heparin; medan de anjoniska heparinskiktet funktioner för att stabilisera och lokalisera laddade tillväxtfaktorer. Den tredubbla lager PEC har visat sig öka tillväxtfaktorlastförmåga på en grismodell 9. Nyligen har PEC bärare visats att framgångsrikt minska den effektiva dosen av BMP-2 med åtminstone 20-faldigt i råtta 10 och svin modeller av ryggradsfusion 8.
ntent "> Här rapporterar vi de metoder för att tillverka PEC för förbättrad tillväxtfaktor leverans i spinal fusion och andra rekonstruktiv ben operationer med hjälp av BMP-2 som en modell osteogen tillväxtfaktor.Detta protokoll presenterar en metod för framställning av PEC genom skikt-vid-skikt självmontering. Den lager-för-lager struktur visualiseras med användning av fluorescerande analoger av protamin, heparin, BMP-2 och NELL-1 och konfokalmikroskopi. Upptag och släppa tester visar att heparin på PEC förmedlar osteogen tillväxtfaktor upptag och utsläpp. Upptagnings effektivitet PEC-metoden är: NELL-1: 86,7 ± 2,7%, BMP-2: 70,5 ± 3,1%. PEC bäraren har en bättre modulering av NELL-1 (20%) frisättning jämfört m…
The authors have nothing to disclose.
These studies were funded by National Medical Research Council Clinician Scientist – Individual Research Grant (CS-IRG) NMRC/CIRG/1372/2013 and NMRC EDG/0022/2008.
Life Science Acrodisc 25mm Syring Filter w/0.2 µm Supor Membrane | PALL | PN4612 | Sterile protamine, heparin solution by ultrafiltration |
24 well plate | Cell Star | 662160 | |
96 well plate Nuclon Delta Surface | Thermo Fisher Scientific | 167008 | |
(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide), MTT | Sigma Aldrich | M5655 | Measure cytotoxicity of PEC-NELL-1 |
Acetone | Fisher Scientific | A/0600/17 | Precipitate CF-405 Labelled protamine |
Alamar Blue | Invitrogen, Life Technologies | DAL 1025 | Measure cytotoxicity of PEC-BMP-2 |
Alkaline Phosphatase Assay (ALP) assay kit | Anaspec | AS-72146 | |
Ammonium Chloride | Merck | Art 1145 | Stop reagent in FITC labelling |
Anhydrous Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Invitrogen, Life Technologies | D12345 | Solvent for fluorescent isothiocyanate I |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | Dissolve formazan | |
Autoclave | Hirayama | HU-110 | Sterilize alginate beads by steam |
Beta-glycerophosphate | Sigma Aldrich | G9422 | |
BMP-2 (Infuse Bone Graft Large II Kit) | Medtronic Sofarmor Danek, Memphis TN, USA | 7510800 | Osteogenic Growth Factor, dialysis is needed to remove stabilizer component that interferes with FITC coupling |
Carboxybenzoyl quinoline-2-Carboxaldehyde (CBQCA) | Thermo Fisher Scientific | A-6222 | To quantify NELL-1 protein |
Cell Strainer (100µm) | BD Science | 352360 | Hold PEC for ALP assay |
Cell Scraper 290mm Bladewide 20mm | SPL Life Science | 90030 | Detach the cell from 24 well plate |
CF 405S, Succinimidyl Ester | Sigma Aldrich | SCJ4600013 | Blue fluorescent dye for protamine labelling |
CF 594, Hydrazide | Sigma Aldrich | SCJ4600031 | Deep red fluorescent dye for heparin labelling |
Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | |
Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | Component of osteogenic growth medium |
Dextran Desalting Columns | Pierce (Thermo Scientific) | 43230 | |
DMEM | Gibco | 12320 | |
BMP-2 Quantikine ELISA Kit | R&D System | DBP200 | Determine BMP-2 release |
Fetal Bovine Serum FBS | Hyclone | SV30160.03 | |
Fluoescein Isothiocyananate, Isomer I | Sigma Aldrich | F7250 | Green fluorescent dye for NELL-1 and BMP-2 labelling |
ThinCert Cell Culture Inserts, For 24 Well plates, Sterile |
Greiner | 662630 | Prevents PEC wash out when changing osteogenic medium |
Havard Appartus Syringe Pump (11 plus) | Havard Apparatus | 70-2208 | |
n-Hexane (>99%) | Sigma Aldrich | 139386 | |
Heparin | Sigma Aldrich | H3149 | Binds with osteogenic growth factor with heparin binding domain |
Hydrochloric acid (37%) | Merck | 100317 | Highly Corrosive |
Incubator | Binder | C8150 | |
MicroBCA Protein Assay kit | Thermoscientific | 23235 | |
Microplate Reader | Tecan | Infinite M200 | For ALP and microBCA assays |
NELL-1 | Aragen Bioscience Morgan Hill, CA, USA | N/A | Osteogenic growth factor, keep at -80˚C |
Nisco cell encapsulator | Nisco Engineering Inc | Encapsulation unit VAR V1 | |
Fluorescent Microscope | Olympus | IX71 | |
mPCL-TCP Scaffold (Pore size is 1.3mm) | Osteopore | PCL-TCP 0/90 | Hold PEC for in vivo study |
Penicillin-Streptomycin 10,000 unit/ml, 100ml | Hyclone Cell Culture | SV30010 | Antibiotic |
10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | Vivantis | PB0344-1L | 10x Solution, Ultra Pure Grade |
Poly-L-Lysine MW 15,000-30,000 | Sigma Aldrich | P2568 | Polycation |
Protamine Sulfate salt, from Salmon | Sigma Aldrich | P4020 | Polycation |
Shaker | Labnet | S2025 | |
Snakeskin Dialysis Tubing 3,500 MWCO 22mm x 35 feet | Thermo Fisher Scientific | 68035 | Remove unreacted FITC by dialysis |
Sodium Chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
Sodium Hydroxide | Qrec | S5158 | |
Sodium Bicarbonate | US Biological | S4000 | Buffer |
Sodium carbonate | Sigma Aldrich | S7795-500G | Buffer |
Strontium Chloride Hexahydrate | Sigma Aldrich | 255521 | Crosslinker for alginate |
Spatula | 3dia | ||
5ml syringe | Terumo | 140425R | Diameter of syringe affects the flow rate |
75cm2 Cell Culture Flask Canted Neck | Corning | 730720 | |
Toluidine Blue | Sigma Aldrich | 52040 | Heparin assay |
Trypsin 1X | Hyclone Cell Culture | SH30042.01 | |
Sodium alginate | Novamatrix (FMC Biopolymer, Princeton, NJ) | Pronova UPMVG | Core material of microbeads |