Saggio di adesione Sotto Shear stress per lo studio di linfociti T-Adhesion Molecule Interazioni
Summary
Questo test di adesione flusso fornisce un semplice, modello alto impatto di cellule epiteliali interazioni delle cellule T. Una pompa siringa viene usato per generare forze di taglio, e la microscopia confocale cattura immagini per la quantificazione. L'obiettivo di questi studi è quello di quantificare in modo efficace l'adesione delle cellule T con condizioni di flusso.
Abstract
Nel complesso, l'adesione cellulare T è un componente critico della funzione, contribuire ai processi distinti di assunzione cellulare per siti di infiammazione e di interazione con cellule presentanti l'antigene (APC) nella formazione di sinapsi immunologica. Questi due contesti di adesione delle cellule T si differenziano che T interazioni cellula-APC può essere considerato statico, mentre le interazioni dei vasi cellule T del sangue sono sfidati dal shear stress generato da circolazione stessa. interazioni cellule T-APC sono classificati come statico dal fatto che i due partner cellulari sono relative statico a vicenda. Solitamente, questa interazione avviene nei linfonodi. Come una cellula T interagisce con la parete dei vasi sanguigni, le cellule arrestano e devono resistere alla sollecitazione di taglio generate. 1,2 Queste differenze evidenziano la necessità di comprendere meglio l'adesione statica e aderenza in condizioni di flusso come due processi normativi distinti. Il regolamento di adesione delle cellule T possono essere più succintamente descritta come contraina stato affinità delle integrine molecole espresse sulla superficie cellulare, e regolando così l'interazione delle integrine con leganti molecola di adesione espresse sulla superficie della cellula interagenti. La nostra attuale comprensione del regolamento di integrine stati affinità viene dal spesso semplicistico nei sistemi modello in vitro. Il saggio di adesione con condizioni di flusso qui descritte permette la visualizzazione e la quantificazione precisa delle cellule epiteliali interazioni delle cellule T in tempo reale dopo uno stimolo. Un'adesione sotto test flusso può essere applicata a studi di aderenza segnalazione all'interno delle cellule T dopo il trattamento con sostanze inibenti o stimolatori. Inoltre, questo test può essere espansa al di là di segnalazione delle cellule T a qualsiasi popolazione adesiva leucociti e qualsiasi coppia molecola di integrina-adesione.
Introduction
T adesione dei linfociti media una serie di processi distinti in un sistema immunitario sano, 3 giocare un ruolo critico nel traffico delle cellule T e presentazione dell'antigene. Sia durante la sorveglianza immunitaria o una risposta immunitaria attiva queste due grandi ruoli per l'adesione sono fondamentali. 4 Gli eventi di segnalazione fisiologiche di cellule endoteliali interazioni delle cellule T sono distinti da cellule T che presentano l'antigene delle cellule (APC) interazioni, e quindi richiedono metodi distinti di studio per comprendere meglio le cascate di segnalazione coinvolte. La ferma adesione di una cellula T a una parete del vaso sanguigno durante linfociti stravaso richiede l'attivazione rapida e dinamica integrina. La stretta interazione tra uno stato attivo integrine e di adesione molecole lungo l'endotelio conduce alla resistenza al flusso di sangue adesione, consentendo alle cellule T per strisciare lungo la superficie alla ricerca di un'area permissivo per il passaggio delle cellule. 5 La scansione di un bi cellule T -directionally alonga parete dei vasi sanguigni è legato alla adesione polarizzato, con una distinta adesiva estremità anteriore della cellula T. 6 Soprattutto, ferma adesione e la trasmigrazione richiedono resistenza alla forza di taglio generata dal flusso di sangue circolante.
Durante la progettazione di esperimenti per studiare l'adesione dei linfociti, occorre prestare attenzione allo stimolo specifico di interesse. Mentre integrina attivazione è un componente comune e critica di tutte le forme di adesione cellulare T, le cascate di attivazione sono suscettibili di essere unico valle dei singoli recettori e corecettori. Allo stesso modo, le coppie integrina e molecola di adesione funzionano in microambienti specializzate e su sottopopolazioni specifiche. In questo modo, queste coppie possono essere regolati in modo diverso. Il modello qui presentato è l'ideale per lo studio delle cascate di segnalazione che portano alla integrina attivazione che si svolgono in condizioni di stress di taglio. 7 Queste interazioni non può essere adeguatamente compreso in un Pellicole staticail sistema a causa dell'impatto hanno dimostrato queste forze di avere direttamente sul comportamento delle cellule T. 8 Anche qui presentata con le cellule T e le cellule CHO (ovaio di criceto cinese) ingegnerizzate per esprimere (cellule CHO-ICAM) umana ICAM-1, il sistema può essere facilmente modificato per studiare diverse popolazioni dei leucociti o molecole di adesione.
Questa analisi fornisce un metodo per quantificare l'adesività delle cellule T e l'attivazione delle integrine con sforzo di taglio, fornendo un modello per lo stadio ferma adesione dei leucociti stravaso. Attraverso l'uso di cellule CHO-ICAM l'affinità di LFA-1 per il suo ligando in cellule vive può essere esaminata in tempo reale in risposta a vari stimoli di interesse. Questa tecnica richiede facilmente ottenuta, disponibili in commercio camere di micro-flusso in combinazione con una pompa a siringa, semplificando notevolmente l'attrezzatura necessaria per modellare il flusso sanguigno e sollecitazione di taglio rispetto ad altri modelli. 9 Un altro importante vantaggio di questo saggio è che la segnalazione specificacascate e lo stato di attivazione risultante singoli integrine possono essere pulito studiate attraverso l'uso di cellule CHO ingegnerizzate esprimono molecole di adesione umani di interesse. Inoltre, la combinazione di dati quantitativi con cellule vive è un significativo vantaggio di questo metodo. Nel complesso, mentre sono stati descritti una serie di saggi di adesione cellulare T statica che ben modellare le interazioni delle cellule T-APC, questi modelli non sono sufficienti a catturare il processo dinamico di adesione delle cellule epiteliali-T. Per questo motivo, quando si sceglie un saggio di adesione deve essere considerato lo stimolo in questione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per analizzare correttamente l'adesione delle cellule T, lo stimolante da includere nello studio deve essere considerato nella scelta di un metodo in vitro. Mentre ci sono diversi metodi per studiare i segnali che portano a LFA-1 attivazione e ICAM-1 vincolante tutti i metodi non sono intercambiabili. Un test di adesione statica 10 è più adatto per studiare le interazioni delle cellule T-APC; In alternativa, il metodo descritto qui sforzo di taglio è ideale per modellare cellule epiteliali int…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Rheumatology Research Foundation and the Hirschil Trust supported this work.
Materials
| T cell samples (cell line or primary) | ATCC | TIB-152 | Peripheral human T cells |
| CHO-ICAM-1 cells | ATCC | CRL-2093 | |
| µ-Slide VI 0.4 ibiTreat | ibidi | 80606 | |
| 500 ml glass bottle | Fisher | FB800500 | |
| 250 ml glass bottle | Fisher | FB800250 | |
| Silicone tubing 0.8 mm | ibidi | 10841 | |
| Confocal microscope with incubator chamber | Ziess | 700 | Any wide field fluorescent microscope |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| 60 ml syringe | BD | 309653 | |
| CFSE | eBioscience | 65-0850 | |
| SDF-1α | R&D | 350-NS-010/CF | |
| RPMI | Lonza | 12-702F/12 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| PMA | Sigma Aldrich | 16561-29-8 | |
| Volocity software | Perkin Elmer | Version 6.2.1 | |
| ImageJ software | NIH | Version 1.48V | |
| Tissue-culture treated culture dishes | Falcon | 353003 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
| Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher | BP295950 |
Riferimenti
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