T Lenfosit-Yapışma Molekülü Etkileşimleri Çalışmaları Yapışma Altında Kesme Stres Testi
Summary
Bu akış yapışma deneyi T hücresi epitel hücre etkileşimleri basit, çok etkili bir model sağlar. Bir şırınga pompası kayma gerilimi oluşturmak için kullanılır ve konfokal mikroskopi ölçümü için görüntü yakalar. Bu çalışmaların amacı, etkili akış koşulları kullanılarak T hücre yapışmasını ölçümüdür.
Abstract
Genel olarak, T hücresi yapışma immünolojik sinaps oluşumunda antijen sunan hücreler (APC) ile birlikte enflamasyon ve etkileşim bölgelerine hücresel alımının has süreçlere katkıda işlev kritik bir unsurdur. T hücresi kan daman etkileşimleri dolaşımı kendisi tarafından üretilen kesme stresi tarafından meydan ise T hücresi yapışma bu iki bağlama, hücre APC etkileşimlerinin statik olarak kabul edilebilir T farklıdır. T hücresi-APC etkileşimlerinin iki hücre ortağı birbirine statik olarak olduğu statik olarak sınıflandırılır. Genellikle, bu etkileşim, lenf düğümleri içinde meydana gelir. Bir T hücresi kan damarı duvarı ile etkileşime gibi, hücreler tutuklama ve üretilen kayma gerilmesi dayanıklı olmalıdır. 1,2 Bu farklılıklar daha iyi iki ayrı düzenleme süreçleri gibi akış koşulları altında statik yapışma ve yapışma anlama ihtiyacını vurgulamaktadır. T hücre yapışmasının düzenlenmesi en özlü con olarak tanımlanabilirhücre yüzeyi üzerinde tanımlı molekülleri integrin ve böylece etkileşim hücrenin yüzeyi üzerinde ifade edilen yapışma molekülü ligandlarla İntegrinlerin etkileşimleri düzenleyen afinitesi durumunu sırtı. Integrin afinite devletlerin düzenleme bizim mevcut anlayış vitro model sistemlerde genellikle basit geliyor. adezyon burada açıklanan akış koşulları kullanılarak tahlil görselleştirme ve bir uyarıcı, aşağıdaki gerçek zamanlı olarak T hücresi epitel hücre etkileşimleri hassas ölçümü sağlar. akış deneyinde küçük bir yapışma önleyici veya uyarıcı maddeler ile tedaviden sonra T hücreleri içinde yer alan sinyal yapışma çalışmalara uygulanabilir. Buna ek olarak, bu deney, bir yapıştırıcı lökosit nüfus ve bir integrin yapışma molekülü çifti, T hücresi sinyal dışına taşabilir.
Introduction
T lemfosit yapışması T hücresi trafiği ve antijen sunumu üzerinde kritik bir rol oynayan 3, sağlıklı bir bağışıklık sisteminin belirgin süreçlerin bir dizi aracılık eder. Immün gözetim veya yapışma için, bu iki geniş roller kritik aktif bir bağışıklık tepkisi sırasında belirtir. 4. T hücresi-endotelyal hücre etkileşimleri fizyolojik sinyal olayları (APC) etkileşimlerinin sergileyen hücre T hücre-antijen farklıdır ve bu nedenle ayrı işlemler gerektiren çalışma en iyi yer sinyalizasyon kaskadlar anlamak için. lenfosit ekstravazasyon sırasında kan damarı çeperi bir T hücresinin Sıkı yapışma, hızlı ve dinamik integrin aktivasyonunu gerektirir. Endotel boyunca aktif bir devlet integrin ve yapışma molekülleri arasındaki sıkı etkileşim T hücreleri hücre geçit keyfi bir alanda arama yüzeyi boyunca tarama sağlayan, kan akışına dayanıklı yapışma yol açar. 5 T hücresi bi taramasını -directionally alonga damar duvarı T hücresinin bir tat yapışkan ön ucu, polarize yapışma bağımlı olduğunu. 6. En önemlisi, sıkıca yapışmasını ve göç kan akımı dolaşan tarafından üretilen kesme kuvvetine direnç gerektirir.
lenfosit yapışma incelemek için deneyler tasarlarken, dikkat ilgi belirli uyarana dikkat edilmelidir. aktivasyonu integrin T hücresi yapışma tüm biçimlerinin yaygın ve ciddi bir komponent ise, aktivasyon kaskadları tek tek reseptör ve ko-reseptörlerin aşağı benzersiz olması muhtemeldir. Aynı şekilde, integrin ve adezyon molekül çiftleri uzman mikroçevrelerde ve belirli alt popülasyonlar üzerinde çalışır. Bu şekilde, bu çiftleri oldukça farklı düzenlenmiş olabilir. Burada sunulan model, makaslama stres koşulları altında yer alan aktivasyon integrin giden sinyal basamaklarının çalışma için idealdir. 7 Bu etkileşimler yeterince statik adhesi içinde anlaşılamazsistemde bağlı etkisi, bu kuvvetler 8 rağmen., T hücresi davranışına doğrudan sahip olduğu gösterilmiş olan insan ICAM-1 (CHO-ICAM hücreleri) ifade etmek üzere geliştirilen T hücreleri ve CHO (Çin hamster yumurtalık) hücreleri sistemi olabilir, burada sunulan kolayca lökosit popülasyonları veya adezyon molekülleri farklı çalışma için modifiye edilebilir.
Bu deney, lökosit ekstravazasyonu Sıkı yapışma aşaması için bir model sağlayarak, kesme zoru stresi ile T hücresi yapışma ve integrin aktivasyonunu ölçmek için bir yöntem sağlar. CHO-ICAM hücreler kullanılarak canlı hücrelerde ligandının LFA-1 afinitesi ilgi çeşitli stimulasyona tepki olarak bir gerçek zamanlı olarak incelenebilir. Bu teknik, kolay büyük ölçüde diğer modellere kıyasla kan akışını ve kesme stresi modellemek için gerekli ekipman basitleştirilmesi, bir şırınga pompası ile kombinasyon halinde ticari olarak temin edilebilen mikro-akış odaları elde gerektirir. 9 Bu testin bir başka önemli avantajı, belirli bir sinyal olduğucascades ve bireysel integrinlerin elde edilen aktivasyon durumu temiz bir ilgi insan adezyon moleküllerini eksprese eden işlenmiş CHO hücrelerinin kullanımı yoluyla incelenebilir. Buna ek olarak, canlı hücre görüntüleme ile nicel veriler kombinasyonu, bu yöntemin önemli bir avantajıdır. Statik T hücre yapışmasının bir çok deney güzel T hücresi-APC etkileşimlerinin model, tarif edilmiş olmasına rağmen, genel olarak, bu modeller, T hücresi-epitelial yapışma dinamik yakalama işlemini yetersizdir. bir yapışma deneyi seçerken Bu nedenle, söz konusu uyaran düşünülmelidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Düzgün T hücre yapışmasını analiz etmek için, uyarıcı bir in vitro yöntem seçerken dikkat edilmesi gereken çalışmaya dahil edilecek. LFA-1 aktivasyonu ve bağlayıcı ICAM-1 giden sinyalleri çalışma için çeşitli tahliller vardır birlikte tüm yöntemler değiştirilemez. Statik yapışma deneyi en iyi 10 T hücre-APC etkileşimleri çalışmak için uygundur; alternatif, burada ayrıntılı kayma gerilmesi yöntemi T hücresi epitel hücre etkileşimleri modellemek için idealdi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Rheumatology Research Foundation and the Hirschil Trust supported this work.
Materials
| T cell samples (cell line or primary) | ATCC | TIB-152 | Peripheral human T cells |
| CHO-ICAM-1 cells | ATCC | CRL-2093 | |
| µ-Slide VI 0.4 ibiTreat | ibidi | 80606 | |
| 500 ml glass bottle | Fisher | FB800500 | |
| 250 ml glass bottle | Fisher | FB800250 | |
| Silicone tubing 0.8 mm | ibidi | 10841 | |
| Confocal microscope with incubator chamber | Ziess | 700 | Any wide field fluorescent microscope |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| 60 ml syringe | BD | 309653 | |
| CFSE | eBioscience | 65-0850 | |
| SDF-1α | R&D | 350-NS-010/CF | |
| RPMI | Lonza | 12-702F/12 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| PMA | Sigma Aldrich | 16561-29-8 | |
| Volocity software | Perkin Elmer | Version 6.2.1 | |
| ImageJ software | NIH | Version 1.48V | |
| Tissue-culture treated culture dishes | Falcon | 353003 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
| Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher | BP295950 |
Riferimenti
- Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Curr Opin Cell Biol. 20 (5), 525-532 (2008).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Dustin, M. L., Bivona, T. G., Philips, M. R. Membranes as messengers in T cell adhesion signaling. Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).
- Mor, A., Dustin, M. L., Philips, M. R. Small GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling. Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).
- Rose, D. M., Alon, R., Ginsberg, M. H. Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration. Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).
- Alon, R., Feigelson, S. W. Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts. Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).
- Su, W., et al. Rap1 and its effector RIAM are required for lymphocyte trafficking. Blood. 126 (25), 2695-2703 (2015).
- Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. Mechanosensing in T lymphocyte activation. Biophys J. 102 (2), L5-L7 (2012).
- Zeltzer, E., et al. Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin. Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).
- Strazza, M., Azoulay-Alfaguter, I., Pedoeem, A., Mor, A. Static adhesion assay for the study of integrin activation in T lymphocytes. J Vis Exp. (88), (2014).
- Ibidi GmbH. Shear stress and shear rates for ibidi μ-Slides – based on numerical calculations. Application Note 11. , (2014).
- van Gijsel-Bonnello, M., et al. Pantethine Alters Lipid Composition and Cholesterol Content of Membrane Rafts, With Down-Regulation of CXCL12-Induced T Cell Migration. J Cell Physiol. 230 (10), 2415-2425 (2015).
- Tozeren, A., et al. Micromanipulation of adhesion of phorbol 12-myristate-13-acetate-stimulated T lymphocytes to planar membranes containing intercellular adhesion molecule-1. Biophys J. 63 (1), 247-258 (1992).
- Mortier, A., Van Damme, J., Proost, P. Overview of the mechanisms regulating chemokine activity and availability. Immunol Lett. 145 (1-2), 2-9 (2012).
- Rot, A. In situ binding assay for studying chemokine interactions with endothelial cells. J Immunol Methods. 273 (1-2), 63-71 (2003).
- Yang, L., et al. ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow. Blood. 106 (2), 584-592 (2005).
- Long, E. O. ICAM-1: getting a grip on leukocyte adhesion. J Immunol. 186 (9), 5021-5023 (2011).
