A fibrose do fígado Modelo dimetilnitrosamina induzida no Rato
Summary
We describe a method to produce an animal model of liver fibrosis in the rat, and assess the degree of fibrosis by histological examination of the liver. The model can be used to study the development of liver disease as well as to test the efficacy of potential anti-fibrotic agents.
Abstract
Quatro a seis semanas de idade, os ratos Wistar machos foram usados para produzir modelos animais de fibrose hepática. O processo requer quatro semanas de administração de 10 mg / kg dimetilnitrosamina (DMN), administrado intraperitonealmente em três dias consecutivos por semana. As injecções intraperitoneais foram realizadas no exaustor de fumos, como é DMN um hepatoxin conhecida e cancerígeno. O modelo apresenta várias vantagens. Em primeiro lugar, alterações hepáticas podem ser estudadas sequencialmente ou em fases particulares de interesse. Em segundo lugar, do estágio da doença do fígado pode ser monitorizado pela medição de alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) enzimas. Em terceiro lugar, a gravidade dos danos no fígado em diferentes fases pode ser confirmada por sacrifício dos animais no ponto de tempo designado, seguido por exame histológico de tecidos do fígado corados Tricoma de Masson. Depois de quatro semanas de dosagem DMN, o marcador típico fibrose é de 5 a 6 na escala de Ishak. O modelo pode ser reproduzido de forma consistente e tem sidoamplamente utilizado para avaliar a eficácia de agentes anti-fibróticos potenciais.
Introduction
DMN é uma toxina específica potente fígado. O seu metabolismo, distribuição nos tecidos, e a capacidade de provocar ferimentos aos fígados de ratos foi relatado por Magee 1, e o mecanismo de dano dos hepatócitos e a morte celular por apoptose foi descrito por Pritchard e Butler 2. Administração intermitente deste composto foi relatada para induzir a fibrose do fígado em cães e ratos 3,4.
Os mecanismos e as alterações morfológicas da fibrose hepática têm sido amplamente estudados usando este modelo. Em estudos iniciais utilizando o rato, o tratamento de 3 semanas com DMN produziu necrose hemorrágica centrolobular seguido de cirrose micronodular sem esteatose 5. Foi demonstrado que, em fibrose precoce, o colagénio formada era mais ligações cruzadas com o tipo III ser mais proeminente do tipo I 6. Em comum com outras causas, alterações fibróticas induzida por DMN estavam associados com um aumento das células de Kupffer; macrófagos hepáticos que residem in sinusóides. Estas células transformar em miofibroblastos e produzem quantidades excessivas de matriz extracelular que é o principal problema na fibrose 7.
Em termos de sinalização celular, Nakamura et ai. Demonstraram que o TGF-β desempenha um papel fundamental na progressão da fibrose hepática 8. Eles usaram um adenovírus que expressa um receptor truncado tipo II TGF-β, para inibir especificamente a sinalização de TGF-β. fibrose hepática nestes ratos foi espetacularmente interrompido durante o tratamento DMN quando comparado ao grupo controle. Outros estudos têm confirmado que a supressão do TGF-β leva até ao alívio de fígado desenvolvimento fibrose 9,10. O modelo também foi utilizado num estudo global perfil genético para identificar outros marcadores de fibrose e proteínas que podem ser utilizadas como alvos de drogas para a terapia anti-fibrótico 11.
Outros agentes químicos usados para induzir a fibrose do fígado incluem tioacetamida (TAA) e Ctetracloreto de Arbon (CCI4). TAA foi usado pela primeira vez em ratos e depois em ratos 12. As vantagens deste modelo incluem: a facilidade de administração química em água, a reprodutibilidade do modelo com cirrose micronodulares característica e alterações bioquímicas beber. As desvantagens incluem: o longo período de tempo de 3 meses para a fibrose hepática e para desenvolver a falta de compreensão do mecanismo molecular para a indução de fibrose hepática. Quanto CCI4, seu uso tem diminuído pelas seguintes razões: não imitar a doença de fígado humano, tem efeitos nocivos na camada de ozono, causa dor e sofrimento aos animais, é muito tóxico para os seres humanos e exige precauções extras em seu manuseio e eliminação 13,14.
Obstrução do ducto biliar prolongada (por intervenção cirúrgica) como um modelo experimental para cirrose hepática foi relatada pela primeira vez por Kountouras et al. 15. Este método não é tóxico para os seres humanos e animais. Ho entanto, o tempo necessário para a fibrose do fígado a desenvolver varia. Uma revisão de 30 relatórios por Marques et al. 16, descobriu que ele tirou de sete dias a quatro semanas após a cirurgia para a fibrose do fígado para se desenvolver. As alterações patológicas descritas imitam os de fibrose biliar humana e crónica do modelo seria mais adequado para investigadores interessados neste domínio.
Em resumo, a administração intermitente de uma dose constante de DMN no rato ao longo de 4 semanas produz fibrose hepática que imita a doença humana. Ratos doseados mostram desenvolvimento progressivo de lesões no fígado e parênquima fibrose 4,17. Progressão e gravidade da doença pode ser monitorizado através de amostras de sangue ou de sacrifício dos animais a pontos de tempo específicos e o efeito é altamente reprodutível 18. Assim, o modelo tem sido amplamente utilizada para estudar os mecanismos de fibrose hepática e cirrose hepática, bem como para o rastreio de potenciais agentes anti-fibróticos 10,19,20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós descrevemos um método para fazer um modelo animal de fibrose hepática e para avaliar a gravidade da fibrose hepática. É importante administrar a dose correcta de DMN e aderir ao esquema de injecções intraperitoneais semanalmente. À medida que a experiência progride, é crucial para pesar os ratos e re-cálculo da dose no início de cada semana de injecções DMN. Tenha em mente que DMN é tóxico e precisa ser tratado no gabinete de fumos. Nós as injecções intraperitoneais no gabinete fume bem. Com a nec…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge the funding support from the Ministry of Education, Singapore, grant number MOE2010-IF-1-025.
Materials
| Dimethylnitrosamine | Wako | 147-03781 | |
| Formalin | Sinopharm chemicals | F63257009 | |
| Ethanol | Sigma | 64-17-5 | |
| Xylene | Fisher | 1330-20-7 | |
| Masson trichome stains | |||
| Aniline Blue | Electron Microscopy Sciences | #42755 | |
| Acid Fuschin | Electron Microscopy Sciences | RT42685 | |
| Scarlet Red | Electron Microscopy Sciences | #26905 | |
| Phosphotungstic Acid Hydrate | ALFA AESAR | ALFA40116.4 | |
| Phosphomolybdic Acid Hydrate | Sigma SG | 221856-25G | |
| Weigert's Iron Hematoxilyn | Merck | 1.15973.0002 | |
| DPX Mounting Medium | Merck | HX066873 | |
| Tissue processor | Leica | Leica TP 1020 | |
| Embedding machine | Sakura | Sakura Tissue Tek TEC5 Embedding System | |
| Microtome | Leica | Leica RM 2235 | |
| Vet Test Analyzer | Idexx | Vet Test 8008 |
Riferimenti
- Magee, P. N. Toxic liver injury; the metabolism of dimethylnitrosamine. Biochem J. 64 (4), 676-682 (1956).
- Pritchard, D. J., Butler, W. H. Apoptosis-the mechanism of cell death in dimethylnitrosamine-induced hepatotoxicity. J Pathol. 158 (3), 253-260 (1989).
- Madden, J. W., Gertman, P. M., Peacock, E. E. Dimethylnitrosamine-induced hepatic cirrhosis: a new canine model of an ancient human disease. Surgery. 68 (1), 260-267 (1970).
- Jenkins, S. A., Grandison, A., Baxter, J. N., Day, D. W., Taylor, I., Shields, R. A dimethylnitrosamine-induced model of cirrhosis and portal hypertension in the rat. J Hepatol. 1 (5), 489-499 (1985).
- Jézéquel, A. M., Mancini, R., Rinaldesi, M. L., Macarri, G., Venturini, C., Orlandi, F. A morphological study of the early stages of hepatic fibrosis induced by low doses of dimethylnitrosamine in the rat. J Hepatol. 5 (2), 174-181 (1987).
- George, J., Chandrakasan, G. Molecular characteristics of dimethylnitrosamine induced fibrotic liver collagen. Biochim Biophys Acta, Protein Struct Mol Enzymol. 1292 (2), 215-222 (1996).
- Winwood, P. J., Arthur, M. J. Kupffer cells: their activation and role in animal models of liver injury and human liver disease. Semin Liver Dis. 13 (1), 50-59 (1993).
- Nakamura, T., Sakata, R., Ueno, T., Sata, M., Ueno, H. Inhibition of transforming growth factorβ prevents progression of liver fibrosis and enhances hepatocyte regeneration in dimethylnitrosamine-treated rats. Hepatology. 32 (2), 247-255 (2000).
- Shek, F. W., Benyon, R. C. How can transforming growth factor beta be targeted usefully to combat liver fibrosis?. Eur J Gastroenterol Hepatol. 16 (2), 123-126 (2004).
- Wang, J. H., Shin, J. W., Son, J. Y., Cho, J. H., Son, C. G. Antifibrotic effects of CGX, a traditional herbal formula, and its mechanisms in rats. J Ethnopharmacol. 127 (2), 534-542 (2010).
- Su, L. J., Hsu, S. L., Yang, J. S., Tseng, H. H., Huang, S. F., Huang, C. Y. F. Global gene expression profiling of dimethylnitrosamine-induced liver fibrosis: from pathological and biochemical data to microarray analysis. Gene Expr. 13 (2), 107-132 (2006).
- Müller, A., Machnik, F., Zimmermann, T., Schubert, H. Thioacetamide-induced cirrhosis-like liver lesions in rats usefulness and reliability of this animal model. Exp Pathol. 34 (4), 229-236 (1988).
- Martinez-Hernandez, A. The hepatic extracellular matrix. II. Electron immunohistochemical studies in rats with CCl4-induced cirrhosis. Lab Invest. 53 (2), 166-186 (1985).
- Pritchard, M. T., Apte, U. Models to Study Liver Regeneration. Liver Regeneration. , 15-40 (2015).
- Kountouras, J., Billing, B. H., Scheuer, P. J. Prolonged bile duct obstruction: a new experimental model for cirrhosis in the rat. Br J Exp Pathol. 65 (3), 305-311 (1984).
- Marques, T. G., Chaib, E., et al. Review of experimental models for inducing hepatic cirrhosis by bile duct ligation and carbon tetrachloride injection. Acta Cir Bras. 27 (8), 589-594 (2012).
- Wasser, S., Tan, C. E. Experimental models of hepatic fibrosis in the rat. Ann Acad Med Singapore. 28 (1), 109-111 (1999).
- George, J., Chandrakasan, G. Biochemical abnormalities during the progression of hepatic fibrosis induced by dimethylnitrosamine. Clin Biochem. 33 (7), 563-570 (2000).
- Shimizu, I., Ma, Y. R., et al. Effects of Sho-saiko-to, a Japanese herbal medicine, on hepatic fibrosis in rats. Hepatology. 29 (1), 149-160 (1999).
- Wang, Y., Gao, J., Zhang, D., Zhang, J., Ma, J., Jiang, H. New insights into the antifibrotic effects of sorafenib on hepatic stellate cells and liver fibrosis. J Hepatol. 53 (1), 132-144 (2010).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. J Vis Exp. (67), (2012).
- Lee, G., Goosens, K. A. Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat. J Vis Exp. (99), (2015).
- Parkinson, C. M., O’Brien, A., Albers, T. M., Simon, M. A., Clifford, C. B., Pritchett-Corning, K. R. Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice. J Vis Exp. (54), (2011).
- Ruehl-Fehlert, C., Kittel, B., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice–part 1. Exp Toxicol Pathol. 55 (2-3), 91-106 (2003).
- Ishak, K., Baptista, A., et al. Histological grading and staging of chronic hepatitis. J Hepatol. 22 (6), 696-699 (1995).
- Sant’Anna, L. B., Sant’Anna, N., Parolini, O. Application of computer assisted image analysis for identifying and quantifying liver fibrosis in a experimental model. J Comput Interdiscip Sci. 2 (2), 139-148 (2011).
