लागू करने प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) द्वारा प्रेरक translocation क्षमता की जांच करने के लिए<em> Coxiella burnetii</em> SiRNA मुंह बंद के दौरान
Summary
बैक्टीरियल रोगज़नक़ों और उनकी सेनाओं के बीच बातचीत की जांच जैविक अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण क्षेत्र है। यहाँ, हम siRNA जीन Blam सब्सट्रेट का उपयोग मुंह बंद करने के दौरान Coxiella burnetii द्वारा प्रेरक translocation को मापने के लिए आवश्यक तकनीक का वर्णन है।
Abstract
Coxiella burnetii, क्यू बुखार की प्रेरणा का एजेंट, एक intracellular रोगज़नक़ है कि एक प्रकार चतुर्थ डॉट / आईसीएम स्राव प्रणाली पर निर्भर करता है एक replicative आला स्थापित करने के लिए है। प्रभावोत्पादक का एक पलटन मेजबान प्रक्रियाओं में हेरफेर और नकल के लिए एक अनूठा lysosome व्युत्पन्न रिक्तिका की स्थापना की अनुमति देने के लिए मेजबान सेल में इस प्रणाली के माध्यम से translocated रहे हैं। विशिष्ट जीन मुंह बंद siRNA का उपयोग कर और एक झल्लाहट आधारित सब्सट्रेट कि β-lactamase गतिविधि पर निर्भर करता है का उपयोग कर प्रेरक स्थानान्तरण के माप: यहां प्रस्तुत विधि दो अच्छी तरह से स्थापित तकनीक के संयोजन शामिल है। इन दोनों के दृष्टिकोण को लागू करने के लिए, हम बैक्टीरियल स्राव प्रणाली समारोह और प्रेरक translocation में मेजबान कारकों की भूमिका को समझने के लिए शुरू कर सकते हैं। इस अध्ययन में हम Rab5A और Rab7A, दोनों endocytic की तस्करी मार्ग के महत्वपूर्ण नियामकों की भूमिका की जांच की। हम प्रेरक translocatio में कमी में या तो प्रोटीन परिणामों की अभिव्यक्ति का मुंह बंद दिखाना है किn दक्षता। इन विधियों को आसानी से अन्य intracellular और बाह्य रोगज़नक़ों कि भी स्राव प्रणाली का उपयोग जांच करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। इस तरह, बैक्टीरियल प्रेरक translocation होस्ट में शामिल कारकों में से एक वैश्विक तस्वीर से पता चला जा सकता है।
Introduction
Coxiella burnetii एक अनूठा intracellular रोगज़नक़ कि जूनोटिक मानव संक्रमण क्यू बुखार का कारण बनता है। यह रोग स्पर्शोन्मुख सेरोकनवर्सन से जीवन के लिए खतरा पुराने संक्रमण है कि अक्सर जोखिम के बाद 1 अन्तर्हृद्शोथ साल के रूप में प्रकट होता है के लिए बढ़ा नैदानिक प्रस्तुतियों की एक व्यापक स्पेक्ट्रम के साथ जुड़ा हुआ है। मानव संक्रमण मुख्य रूप से जुगाली करने वाले पशुओं के संक्रमण के लिए प्रमुख जलाशय, विशेष रूप से, डेयरी गाय, भेड़ और बकरियों में से दूषित एयरोसौल्ज़ के साँस के माध्यम से होता है। हालांकि इन पशुओं में संक्रमण आम तौर पर Coxiella उपनैदानिक है, संक्रमण गर्भपात को गति प्रदान कर सकते हैं और birthing तरल पदार्थ और प्लेसेंटा के भीतर काफी बैक्टीरियल लोड स्थानीय पर्यावरण 1 दूषित कर सकते हैं। भारी बोझ इस तरह के प्रदूषण का एक उदाहरण दोनों सार्वजनिक स्वास्थ्य और कृषि उद्योग के हाल ही में क्यू बुखार के प्रकोप है कि नीदरलैंड में हुई 2 में मनाया गया था पर हो सकता है। 2007 और बीच2010, क्यू बुखार के 4,000 से अधिक मामलों का निदान किया गया और इस प्रकोप बकरी खेतों 3 के महत्वपूर्ण संदूषण से जुड़ा हुआ था। इसके अतिरिक्त, Coxiella एक संभावित जैविक हथियार के रूप में बैक्टीरिया और कम संक्रामक खुराक आवश्यक के पर्यावरणीय स्थिरता गंभीर रुग्णता और मृत्यु दर 4 कारण की वजह से अमेरिकी केंद्र रोग नियंत्रण और रोकथाम के लिए, द्वारा वर्गीकृत है।
Coxiella दो चरणों में मौजूद है: मैं चरण जीवों, प्राकृतिक स्रोतों से अलग, बेहद ज़हरीले होते हैं और द्वितीय चरण जीवों अत्यधिक विवो में तनु रहे हैं। उदाहरण के लिए, Coxiella burnetii नौ माइल मैं चरण जीवों की कई इन विट्रो मार्ग के बाद, द्वितीय चरण बैक्टीरिया का उत्पादन किया गया है कि एक अपरिवर्तनीय गुणसूत्र विलोपन छोटा lipopolysaccharide में जिसके परिणामस्वरूप होते हैं (एलपीएस) 5। इस तनाव, सी burnetii NMII, टिशू कल्चर मॉडल में मैं चरण के लिए phenotypically समान है और एक सुरक्षित मोड प्रदान करता हैशोधकर्ताओं प्रयोगशालाओं 5 में Coxiella रोगजनन का अध्ययन करने के लिए एल। हाल के वर्षों में कई सफलताओं तेजी से Coxiella आनुवांशिकी के क्षेत्र उन्नत है। सबसे विशेष रूप से, axenic मीडिया के विकास (अम्लीय साइट्रेट सिस्टीन मध्यम – ACCM -2) दोनों में तरल और ठोस मीडिया पर 6.7 Coxiella की सेल मुक्त वृद्धि की अनुमति दी गई है। यह एक inducible जीन अभिव्यक्ति प्रणाली, शटल वैक्टर और यादृच्छिक transposon सिस्टम 8-11 सहित Coxiella के लिए उपलब्ध आनुवंशिक उपकरणों के प्रत्यक्ष सुधार के परिणामस्वरूप। अभी हाल ही में लक्षित जीन निष्क्रियता के लिए दो तरीकों में भी विकसित किया गया है, विशिष्ट डाह जीन उम्मीदवारों 12 की जांच के लिए रास्ता साफ हो गया।
वायुकोशीय मैक्रोफेज द्वारा internalization के बाद, Coxiella एक झिल्ली ही सीमित डिब्बे के भीतर उच्च संख्या के लिए प्रतिकृति Coxiella- युक्त रिक्तिका (CCV) करार दिया। CCV मेजबान endocytic की तस्करी वीं की आवश्यकता हैकिसी न किसी तरह जल्दी और देर endosomes जब तक यह एक lysosome व्युत्पन्न organelle 13 में परिपक्व होती है। इस प्रक्रिया के दौरान, CCV मेजबान कारकों है कि या तो क्षणिक दिखाई देते हैं या रिक्तिका के साथ जुड़े रहते हैं, जिनमें शामिल हैं, लेकिन करने के लिए, Rab5, Rab7, CD63 और दीपक -1 13-15 सीमित नहीं प्राप्त कर लेता है। मेजबान कोशिकाओं के भीतर Coxiella की प्रतिकृति पूरी तरह से एक पूरी तरह कार्यात्मक डॉट / आईसीएम प्रकार IVB स्राव प्रणाली (T4SS) 8,16,17 पर निर्भर है। यह स्राव प्रणाली ancestrally विकार प्रणाली से संबंधित एक बहु प्रोटीन संरचना है और दोनों बैक्टीरियल और vacuolar झिल्ली तक फैला बैक्टीरियल प्रोटीन देने के लिए, प्रभावोत्पादक करार दिया मेजबान कोशिका द्रव्य 18 में। Coxiella T4SS कार्यात्मक बहुत अच्छी तरह से होती प्रकार IVB डॉट / आईसीएम स्राव लीजोनेला pneumophila 19,20 की व्यवस्था करने के समान है। दिलचस्प बात यह है T4SS और बाद में प्रेरक स्थानान्तरण के सक्रियण उत्पन्न नहीं होती है जब तक Coxiella अम्लीय lysosome व्युत्पन्न पहुंचता हैorganelle, लगभग 8 घंटे के बाद संक्रमण 17,21। तिथि करने के लिए, 130 से अधिक डॉट / आईसीएम प्रभावोत्पादक 9,17,22-24 पहचान की गई है। इन प्रभावोत्पादक से कई की संभावना मेजबान कोशिकाओं के भीतर Coxiella की प्रतिकृति के दौरान महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं; हालांकि, केवल कुछ ही प्रभावोत्पादक कार्यात्मक 25-29 विशेषता किया गया है।
इस अध्ययन में हम एक प्रतिदीप्ति आधारित परख कि CCF2-AM झल्लाहट सब्सट्रेट (इसके बाद Blam सब्सट्रेट के रूप में) मेजबान कोशिका कोशिका द्रव्य के भीतर β-lactamase गतिविधि के माध्यम से (चित्रा 1) की दरार पर निर्भर करता है का उपयोग। ब्याज की जीन मंदिर 1 करने के लिए एक संवाददाता प्लाज्मिड कि विधान अभिव्यक्ति प्रदान करता है पर β-lactamase (Blam) जुड़े हुए है। Blam सब्सट्रेट दो fluorophores (coumarin और fluorescein) है कि एक झल्लाहट जोड़ी फार्म से बना है। fluorescein और प्रेरक स्थानान्तरण के अभाव में हरी प्रतिदीप्ति उत्सर्जन की झल्लाहट में कूमेरिन परिणामों की उत्तेजना; हालांकि, अगर Blaएम प्रेरक संलयन प्रोटीन मेजबान कोशिका द्रव्य में translocated है, उसके एवज में β-lactamase गतिविधि cleaves Blam सब्सट्रेट के β लस्टम अंगूठी, झल्लाहट नीले प्रतिदीप्ति उत्सर्जन उत्तेजना निम्न उत्पादन जोड़ी अलग। यह अच्छी तरह से परख के लिए एक दृष्टिकोण अलग intracellular और बाह्य बैक्टीरिया की एक श्रृंखला, सी सहित से प्रेरक प्रोटीन की पहचान के रूप में साबित किया गया है burnetii, एल pneumophila, एल longbeachae, क्लैमाइडिया ट्रैकोमैटिस, enteropathogenic ई कोलाई, साल्मोनेला और ब्रूसिला 17,30-35।
Coxiella प्रेरक translocation पर विशिष्ट मेजबान कारकों की भूमिका का निर्धारण करने के लिए हम जीन आरएनए हस्तक्षेप के रूप में जाना जाता मुंह बंद करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित विधि का उपयोग, विशेष रूप से छोटे दखल शाही सेना में (siRNA)। मूलतः Caenorhabditis एलिगेंस में पहचान, आरएनए हस्तक्षेप जन्मजात defe के लिए इस्तेमाल एक संरक्षित अंतर्जात सेलुलर प्रक्रिया हैवायरस के खिलाफ एनएसई के साथ ही जीन विनियमन 36,37। अनुक्रम विशिष्ट siRNA के बंधन के बाद, mRNA की गिरावट (आरएनए प्रेरित मुंह बंद जटिल) RISC के माध्यम से होता विशिष्ट जीन मुंह बंद करने या पछाड़ना 38 में जिसके परिणामस्वरूप। इस अध्ययन में, siRNA दो मेजबान प्रोटीन, Rab5A और Rab7A, जो endocytic मार्ग के महत्वपूर्ण नियामकों हैं निशाना बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया था। प्रेरक translocation पर Rab5A और Rab7A मुंह बंद के प्रभाव का उपयोग करते हुए सी का पता लगाया गया था burnetii pBlaM-CBU0077। के रूप में यह पहले से Coxiella 17 डॉट / आईसीएम स्राव प्रणाली द्वारा translocated होना दिखाया गया था CBU0077 चुना गया था।
दोनों siRNA जीन मुंह बंद करने और fluorescencebased परख यहाँ वर्णित का उपयोग, हम Coxiella द्वारा प्रेरक प्रोटीन के translocation में मेजबान कारकों के लिए एक रोल स्थापित करने की शुरुआत कर रहे हैं। यह दृष्टिकोण दोनों intracellular और बाह्य बैक्टीरिया है कि इसी तरह secretio अधिकारी की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू किया जा सकताn प्रेरक प्रोटीन के translocation के लिए जिम्मेदार प्रणालियों।
Protocol
Representative Results
Discussion
स्राव सिस्टम, और बैक्टीरियल प्रेरक प्रोटीन मेजबान कोशिकाओं की कोशिका द्रव्य में इन प्रणालियों परिवहन, एक महत्वपूर्ण घटक है कि कई डाह रोगजनक बैक्टीरिया अद्वितीय replicative आलों के भीतर एक संक्रमण की स्थापन…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Health and Medical Research Council (NHMRC) grants (Grant ID 1062383 and 1063646) awarded to HJN. EAL is supported by an Australian Postgraduate Award.
Materials
| Reagents | |||
| Citric acid | Sigma | C0759 | ACCM-2 medium component |
| Sodium citrate | Sigma | S4641 | ACCM-2 medium component |
| Potassium phosphate | Sigma | 60218 | ACCM-2 medium component |
| Magnesium chloride | Calbiochem | 442611 | ACCM-2 medium component |
| Calcium chloride | Sigma | C5080 | ACCM-2 medium component |
| Iron sulfate | Fisher | S93248 | ACCM-2 medium component |
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | ACCM-2 medium component |
| L-cysteine | Sigma | C6852 | ACCM-2 medium component |
| Bacto-neopeptone | BD | 211681 | ACCM-2 medium component |
| Casamino acids | Fisher | BP1424 | ACCM-2 medium component |
| Methyl beta cyclodextrin | Sigma | C4555 | ACCM-2 medium component |
| RPMI + Glutamax | ThermoFisher Scientific | 61870-036 | ACCM-2 medium component |
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | For bacterial culture |
| ON-TARGETplus Non-targeting Control Pool (OTP) | Dharmacon | D-001810-10-05 | Non-targeting control |
| siGENOME Human PLK1 (5347) siRNA – SMARTpool | Dharmacon | M-003290-01-005 | Causes cell death; measure of transfection efficiency |
| siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA – SMARTpool | Dharmacon | M-004009-00-0005 | |
| siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA – SMARTpool | Dharmacon | M-010388-00-0005 | |
| 5X siRNA buffer | Dharmacon | B-002000-UB-100 | Use sterile RNase-free water to dilute 5X siRNA buffer to 1X siRNA buffer |
| DharmaFECT-1 Transfection Reagent | Dharmacon | T-2001-01 | For transfection |
| Opti-MEM + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 51985-034 | Reduced-serum medium used for transfection |
| DMEM + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 10567-014 | For cell culture and infection |
| Heat-inactivated fetal calf serum (FCS) | Thermo Scientific | SH30071.03 | Can use alternate equivalent product |
| DMSO | Sigma | D8418 | For storage of Coxiella strain |
| PBS | For cell culture | ||
| 0.05% Trypsin + EDTA | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | For cell culture |
| dH2O | For dilution of samples and standards for qPCR | ||
| Quick-gDNA Mini Prep | ZYMO Research | D3007 | Can use alternate equivalent product to extract gDNA |
| SensiFAST SYBR No-ROX Kit | Bioline | BIO-98020 | Can use alternate equivalent qPCR master mix product for qPCR reaction |
| LiveBLAzer FRET-B/G Loading kit with CCF2-AM | Invitrogen | K1032 | For measurement of translocation using fluorescence and generation of the 6X loading solution (contains Solution A, B, C and DMSO) |
| Sodium hydroxide | Merck | 106469 | Probenicid solution component |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | 71505 | Probenicid solution component |
| di-Sodium hydrogen orthophosphate | Merck | 106586 | Probenicid solution component |
| Probenicid | Sigma | P8761 | Probenicid solution component |
| DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM) | ThermoFisher Scientific | 62251 | Nuclei stain to determine cell viablity. Use 1:4000 diluted in PBS. |
| 4% PFA (paraformaldehyde) solution in PBS | Sigma | P6148 | Fixing solution for HeLa 229 cells |
| 25cm2 tissue culture flask with vented cap | Corning | 430639 | For growth of bacterial strain |
| 96 Well Flat Clear bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually wrapped, with Lid, Sterile | Corning | 3603 | |
| 75cm2 tissue culture flask with vented cap | Corning | 430641 | For growth of HeLa 229 cells |
| 175cm2 tissue culture flask with vented cap | Corning | 431080 | For growth of HeLa 229 cells |
| Haemocytometer | For quantification of HeLa 229 cells | ||
| Tear-A-Way 96 Well PCR plates | 4titude | 4ti-0750/TA | For qPCR reaction |
| 8-Lid chain, flat | Sarstedt | 65.989.002 | For qPCR reaction |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Bench top microfuge | |||
| Bench top vortex | |||
| Orbital mixer | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | For pelleting bacterial culture |
| Nanodrop | For gDNA quantification | ||
| Mx3005P QPCR machine | Aligent Technologies | 401456 | For quantification of Coxiella genomes in 7 day culture |
| ClarioSTAR microplate reader | BMG LabTech | For measurement of fluorescence |
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